【摘要】：研究背景 腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)是一種以腹痛或腹部不適伴排便習(xí)慣改變和(或)糞便性狀改變的功能性腸病,該病缺乏可解釋癥狀的形態(tài)學(xué)改變和生化異常,其患病率逐年增高,與精神心理因素和感染因素密切相關(guān)。腹瀉型腸易激綜合征(IBS-D)是我國(guó)IBS最常見的類型,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,包括內(nèi)臟感覺過敏、腸道動(dòng)力增強(qiáng)、腦腸作用異常、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)異常等。近年來對(duì)IBS-D發(fā)病機(jī)制的研究逐漸深入到了分子水平,但還比較片面。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝郁脾虛是其基本病機(jī),肝郁脾虛證是其最主要的證型。西藥作用靶點(diǎn)單一,難以解決IBS-D復(fù)雜的臨床癥狀,中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)作用整體治療的優(yōu)勢(shì)。目前對(duì)IBS-D動(dòng)物模型的研究尚處于探索階段,其造模方法還不成熟,動(dòng)物模型穩(wěn)定性欠佳,深入全面研究IBS-D的發(fā)病機(jī)制需要建立一種穩(wěn)定的重復(fù)性好的動(dòng)物模型。進(jìn)一步建立IBS-D肝郁脾虛型病證結(jié)合動(dòng)物模型有利于研究中藥復(fù)方的作用機(jī)理,對(duì)于開發(fā)新藥,發(fā)揮中醫(yī)藥治療IBS-D的優(yōu)勢(shì)具有推動(dòng)作用。 第一部分:IBS-D大鼠模型制作方法的探索 目的：探索建立IBS-D大鼠模型的理想制作方法 材料和方法：本部分研究采用新生雌性SD大鼠造模,分為正常對(duì)照組、番瀉葉高劑量組、中劑量組、低劑量組、高乳糖飼料組、醋酸灌腸組和5-HT腹腔注射組,每組10只。除正常組外,其余各組大鼠采用新生期母子分離法建立內(nèi)臟高敏感模型,即出生后第2-14天,每天與母鼠分離3h,2月后選擇體重大于250g的大鼠進(jìn)行致瀉造模。番瀉葉高劑量組給予番瀉葉煎劑4.5g/kg、中劑量組給予3g/kg、低劑量組給予2g/kg灌胃,灌胃體積為10ml/kg,連續(xù)7天,給予普通飼料喂養(yǎng)；高乳糖組采用高乳糖飼料喂養(yǎng),7天后換用普通飼料；醋酸灌腸組給予4%的醋酸灌腸1ml,灌腸1次,普通飼料喂養(yǎng),此后不做任何處理；5-HT腹腔注射組給予5-HT2.1mg/kg腹腔注射,連續(xù)7天,普通飼料喂養(yǎng)；正常組不給于任何處理。觀察各組大鼠造模期間的腹瀉率,造模后1周每天的大便積分(硬便1分,軟便2分,不成形便3分),造模前后的體重增長(zhǎng)情況以及近端結(jié)腸的病理組織學(xué)變化。 結(jié)果：(1)腹瀉率：番瀉葉高劑量組(4.5g/kg)、高乳糖飼料組和醋酸灌腸組大鼠腹瀉率均為100%,其余各組均未出現(xiàn)腹瀉。(2)體重增長(zhǎng)量：與正常組大鼠相比,除番瀉葉低劑量組大鼠體重?zé)o明顯變化外,其余各組體重增長(zhǎng)量均顯著降低,具有顯著性差異(P0.01),其中高乳糖飼料組和醋酸灌腸組大鼠體重出現(xiàn)明顯的負(fù)增長(zhǎng)。(3)大便積分：造模后番瀉葉高劑量組和醋酸灌腸組大鼠6天內(nèi)的平均大便積分顯著高于正常組,具有顯著性差異(P0.05,P0.01)。(4)近端結(jié)腸病理：高乳糖組可見淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞間質(zhì)輕度水腫；醋酸灌腸組部分結(jié)腸與腹腔組織粘連、增厚,結(jié)腸縮短,近端結(jié)腸可見粘膜輕度充血,絨毛變鈍,其余各組未見異常。 結(jié)論：(1)母子分離+適當(dāng)劑量的番瀉葉灌胃是復(fù)制IBS-D動(dòng)物模型較為合理的造模方法。(2)基于大便基本特征和病理組織學(xué)改變是判定IBS-D動(dòng)物模型是否成功的重要依據(jù)之一。 第二部分：IBS-D肝郁脾虛型病證結(jié)合大鼠模型的建立與評(píng)價(jià) 目的：建立IBS-D肝郁脾虛型病證結(jié)合大鼠模型。 材料和方法：本部分研究采用新生SD雄性大鼠造模,分為正常組、正常束縛組、母子分離組、分離+束縛組(模型組)和以方測(cè)證組,每組20只大鼠�；诘谝徊糠盅芯拷Y(jié)論選擇母子分離+番瀉葉灌胃復(fù)制IBS-D大鼠模型,采用慢性束縛應(yīng)激復(fù)制肝郁脾虛證候模型,將二者疊加建立IBS-D肝郁脾虛型病證結(jié)合大鼠模型。分三步造模,第一步：正常組和正常束縛組大鼠新生期母子不分離,其余各組于出生后第2-14天,每天與母鼠分離3h；第二步：各組大鼠2月齡時(shí),正常組和母子分離組不處理,其余各組采用自制束縛架,束縛肩部和腹部,使其固定不動(dòng),每天束縛3h,連續(xù)3周；第三步：束縛造模期第2周開始每天上午9點(diǎn)給予以方測(cè)證組大鼠灌服痛瀉要方煎劑(3g/kg,10ml/kg),其余各組灌服生理鹽水(10ml/kg),第3周開始,正常束縛組、母子分離組和模型組每天上午9點(diǎn)灌服生理鹽水,下午4點(diǎn)灌服番瀉葉煎劑(4.5g/kg,10ml/kg),乙方測(cè)證組上午灌服痛瀉要方煎劑,下午灌服番瀉葉煎劑,正常對(duì)照組上下午均灌服生理鹽水。從宏觀疾病特征、宏觀證候特征和微觀生物學(xué)指標(biāo)三個(gè)方面對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。宏觀疾病特征評(píng)價(jià)方法：束縛造模前后檢測(cè)各組大鼠的內(nèi)臟敏感性(痛覺閾值)、測(cè)評(píng)束縛期間和造模后各組大鼠的大便積分(計(jì)分方法同前)。宏觀證候特征評(píng)價(jià)方法：肝郁的評(píng)價(jià)于束縛造模期前后觀察各組大鼠曠場(chǎng)行為學(xué)、糖水偏好率、懸尾不動(dòng)時(shí)間,脾虛的評(píng)價(jià)通過觀察各組大鼠在束縛期間的體重增長(zhǎng)情況以及造模后的進(jìn)食量。微觀生物學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)：檢測(cè)血清D-木糖、5-HT、BDNF、IgA、 IgG含量；采用流式細(xì)胞儀分析血液和胸腺組織的T淋巴細(xì)胞亞群分布,比較各組大鼠的脾臟指數(shù)；采用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)近端結(jié)腸和末端回腸組織中的肥大細(xì)胞和嗜鉻細(xì)胞數(shù)目變化；評(píng)價(jià)近端結(jié)腸和末端回腸的病理組織學(xué)變化。 結(jié)果：(1)痛覺閾值：造模結(jié)束后,母子分離組和模型組大鼠痛覺閾值較正常組明顯降低(均P0.01),正常束縛組痛覺閾值與正常組無顯著性差異,痛瀉要方可提高模型組大鼠的痛覺閾值(P0.01)。(2)大便情況：短期束縛應(yīng)激可使大鼠排便粒數(shù)明顯增加,長(zhǎng)期束縛應(yīng)激對(duì)大鼠排便粒數(shù)無明顯影響,但可使其大便含水量增加,甚至不成形。造模結(jié)束后,5天內(nèi)的平均大便積分模型組顯著高于正常組、正常束縛組和母子分離組(均P0.01),痛瀉要方對(duì)模型組大鼠的腹瀉情況無明顯改善。(3)體重增長(zhǎng)量：造模結(jié)束后,正常束縛組、母子分離組和模型組大鼠的體重增長(zhǎng)量均較正常組降低(均P0.01),痛瀉要方對(duì)模型組大鼠的體重?zé)o明顯影響。(4)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：造模結(jié)束后,正常束縛組、母子分離組、模型組大鼠的穿格數(shù)和站立數(shù)均較正常組減少(均P0.05),痛瀉要方可提高模型組大鼠的穿格數(shù)和站立數(shù)(P0.05)。(5)糖水偏好率：造模結(jié)束后,正常束縛組、母子分離組和模型組的糖水偏好率均較正常組降低(P0.01,P0.05,P0.01),痛瀉要方可提高模型組大鼠的糖水偏好率(P0.05)。(6)懸尾不動(dòng)時(shí)間：造模結(jié)束后,正常束縛組、母子分離組和模型組大鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間較正常組延長(zhǎng)(P0.01,P0.05,P0.05),痛瀉要方可縮短模型組大鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間(P0.05)。(7)進(jìn)食量：造模后正常束縛組、母子分離組和模型組大鼠平均進(jìn)食量與正常組比較無明顯變化,痛瀉要方可提高模型組的進(jìn)食量(P0.05)。(8)血清指標(biāo)：造模結(jié)束后,血清D-木糖含量正常束縛組、母子分離組和模型組較正常組明顯降低(均P0.01),痛瀉要方對(duì)模型組大鼠的血清D-木糖含量無明顯影響。血清5-HT正常束縛組與正常組比較無顯著性差異,母子分離組和模型組較正常組升高(均P0.01),痛瀉要方可降低模型組大鼠的血清5-HT含量(P0.01)。血清BDNF各組之間無顯著性差異。血清IgA母子分離組和模型組較正常組升高(均P0.05),正常束縛組和正常組無顯著性差異；痛瀉要方對(duì)模型組大鼠血清IgA水平無明顯影響。血清IgG母子分離組和模型組與正常組無顯著性差異,痛瀉要方對(duì)模型組血清IgG無明顯影響。(9)T淋巴細(xì)胞亞群比例：造模結(jié)束后,血液Th (CD3+CD4+CD8-)亞群比例正常束縛組、母子分離組和模型組較正常組升高(均P0.05),Tc (CD3+CD4-CD8+)亞群比例較正常組降低(均P0.01),胸腺T總細(xì)胞比例較正常組升高(均P0.05),痛瀉要方對(duì)模型組的血液和胸腺T淋巴細(xì)胞亞群比例無明顯影響。(10)脾臟指數(shù)：母子分離組和模型組較正常組降低(均P0.01),正常束縛組和正常組無顯著性差異,痛瀉要方對(duì)模型組脾臟指數(shù)無明顯影響。(11)近端結(jié)腸肥大細(xì)胞數(shù)目：模型組較正常組增多(P0.01),正常束縛組和母子分離組與正常組無顯著性差異,痛瀉要方可顯著減少模型組大鼠近端結(jié)腸的肥大細(xì)胞數(shù)目(P0.01)。(12)嗜鉻細(xì)胞數(shù)目：正常束縛組、母子分離組和模型組近端結(jié)腸和末端回腸中的肥大細(xì)胞數(shù)目均較正常組增多(均P0.01),痛瀉要方對(duì)模型組大鼠近端結(jié)腸組織中的嗜鉻細(xì)胞數(shù)目無明顯影響。(13)組織病理：各組大鼠近端結(jié)腸和末端回腸病理檢查未見明顯異常。 結(jié)論：(1)采用母子分離+慢性束縛應(yīng)激+番瀉葉灌胃可成功建立IBS-D肝郁脾虛型病證結(jié)合大鼠模型。(2)采用慢性束縛聯(lián)合母子分離法造模優(yōu)于單一因素法。(3)本研究所建立的IBS-D肝郁脾虛型大鼠模型具有內(nèi)臟高敏感性、腸道通透性增加、抑郁和免疫功能異常等多種特征。(4)根據(jù)IBS-D肝郁脾虛證患者的宏觀疾病、證候特征和微觀生物學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)動(dòng)物模型是否成功的方法科學(xué)、合理,具有可行性。 第三部分：IBS-D肝郁脾虛型大鼠模型結(jié)腸和腦的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 目的：基于第二部分大鼠模型,從結(jié)腸和腦組織中篩選和鑒定與IBS-D發(fā)病相關(guān)的差異蛋白,并進(jìn)行對(duì)比分析。 材料和方法：采用第二部分正常組、正常束縛組、母子分離組和模型組大鼠的近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸和全腦組織樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。利用iTRAQ技術(shù)篩選各組樣本中的差異蛋白,采用Mascot軟件對(duì)差異蛋白的質(zhì)譜信息進(jìn)行鑒定和定量分析,然后基于Uniprot和Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定到的差異蛋白進(jìn)行功能注釋,采用IPA軟件分析各組差異蛋白涉及到的生物通路和相互作用關(guān)系。并采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)從基因水平對(duì)選定差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：(1)與正常組比較,在正常束縛組大鼠結(jié)腸組織中篩選和鑒定出了542個(gè)差異表達(dá)蛋白(差異倍數(shù)1.2,P0.05),其中309個(gè)上調(diào),233個(gè)下調(diào),腦組織中篩選和鑒定出了1884個(gè)差異蛋白,其中764個(gè)上調(diào),1120個(gè)下調(diào)；母子分離組結(jié)腸組織中篩選和鑒定出了809個(gè)蛋白,其中415個(gè)上調(diào),394個(gè)下調(diào),腦組織篩選和鑒定出了2386個(gè)蛋白,其中1080個(gè)上調(diào),1306個(gè)下調(diào)；模型組結(jié)腸組織中篩選和鑒定出了731個(gè)差異蛋白,其中424個(gè)上調(diào),307個(gè)下調(diào),腦組織中篩選和鑒定出了2567個(gè)差異蛋白,其中1187個(gè)上調(diào),1380個(gè)下調(diào)。(2)正常束縛組、母子分離組和分離束縛組在結(jié)腸組織中有192個(gè)差異蛋白共同表達(dá),在腦組織中有1501個(gè)差異蛋白共同表達(dá)。(3)在正常束縛組,有153個(gè)差異蛋白在腦和腸組織共同表達(dá),母子分離組有280個(gè)差異蛋白在腦和腸組織共同表達(dá),分離束縛組有239個(gè)蛋白在腦和腸組織中共同表達(dá)。三組均有55個(gè)差異蛋白在腦和腸組織中共同表達(dá)。(4)模型組結(jié)腸組織中差異倍數(shù)3蛋白有6個(gè),其中4個(gè)上調(diào)：S腺苷甲硫氨酸脫羧酶酶原、內(nèi)凝集素蛋白、FH2區(qū)包含蛋白1、主要組織相溶性復(fù)合體Ⅱ類抗原；2個(gè)下調(diào)：磷脂酰肌醇特異的磷脂酶CX區(qū)包含蛋白3、血紅蛋白α亞。這些蛋白主要參與了S腺苷甲硫氨酸合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組裝、免疫反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)過程。腦組織中差異倍數(shù)4的蛋白有22個(gè),其中4個(gè)上調(diào)：過氧化物酶膜蛋白PEX14、NADH泛醌氧化還原酶鏈2、唐氏綜合癥臨界區(qū)域基因3、Lrba蛋白；18個(gè)下調(diào)：血紅蛋白p亞基、胸腺旁腺素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞色素C氧化酶6B1亞基、40s核糖體蛋白、ATP合成酶d亞基、線粒體輸入內(nèi)膜移位酶亞基Tim13、NADH脫氫酶黃素蛋白3、細(xì)胞色素C氧化酶5A亞基、浦肯野細(xì)胞蛋白4、ATP合酶藕聯(lián)因子6、脂酰輔酶A結(jié)合蛋白、細(xì)胞色素C、金屬硫蛋白3、肌動(dòng)蛋白相互作用蛋白1、泛醌細(xì)胞色素C還原酶結(jié)合蛋白、甘油醛3磷酸脫氫酶、胸腺素p4。這些蛋白參與了蛋白質(zhì)運(yùn)輸、電子傳遞、空泡運(yùn)輸、氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌、rRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、金屬離子結(jié)合、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組裝、核苷酸代謝等。在模型組腸組織中鑒定出的熱休克蛋白27、免疫球蛋白J鏈表達(dá)上調(diào)、血紅蛋白α亞基、血紅蛋白β亞基表達(dá)下調(diào),這些蛋白與臨床報(bào)道一致。(5)模型組結(jié)腸組織的差異蛋白功能主要與細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞的功能和修復(fù)、細(xì)胞死亡和生存、細(xì)胞形態(tài)、組織發(fā)育、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能、細(xì)胞與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和相互作用、小分子生物化學(xué)等有關(guān),腦組織的差異蛋白功能主要與細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞的功能和修復(fù)、細(xì)胞死亡和生存、細(xì)胞形態(tài)、小分子生物化學(xué)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能、小分子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞發(fā)育、組織發(fā)育和核苷酸代謝等有關(guān)。(6)模型組大鼠結(jié)腸組織中的差異蛋白主要涉及了整合素信號(hào)、5-HT降解信號(hào)、抗原呈遞通路、白介素4信號(hào)等27個(gè)生物通路,腦組織的差異蛋白主要涉及了間隙連接信號(hào)、上皮黏著連接信號(hào)、線粒體功能障礙等26個(gè)生物通路。結(jié)腸組織中存在9類差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),腦組織中存在12類差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。(7)結(jié)腸組織AQP8mRNA、NHE3mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平一致,結(jié)腸和海馬BDNFmRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)水平不完全一致。 結(jié)論：(1)IBS-D肝郁脾虛證大鼠模型結(jié)腸和腦組織中存在大量差異表達(dá)的蛋白,部分蛋白與臨床報(bào)道一致,該模型具備IBS-D的病理特征。(2) IBS-D肝郁脾虛證大鼠模型結(jié)腸和腦組織中存在大量共同表達(dá)的差異蛋白,表達(dá)方式多樣,印證了IBS-D腦腸相互作用異常的機(jī)制。(3)慢性束縛應(yīng)激、母子分離應(yīng)激以及二者聯(lián)合作用具有共同的分子生物學(xué)基礎(chǔ),二者聯(lián)合對(duì)腦組織差異蛋白表達(dá)的影響具有協(xié)同作用。(4)IBS-D發(fā)病與多種蛋白質(zhì)分子改變有關(guān),深入研究各差異蛋白的功能可進(jìn)一步闡明IBS-D的發(fā)病機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R-332;R259

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