【摘要】：基因敲除動(dòng)物模型對于了解生命活動(dòng)的機(jī)制,疾病的機(jī)理以及藥物的篩選有著重大的意義。得益于和人類生理和遺傳上的相似性,以及基于干細(xì)胞內(nèi)同源重組的基因敲除技術(shù)的出現(xiàn),近幾十年來基因敲除小鼠模型在生物醫(yī)學(xué)研究中起著舉足輕重的作用。與小鼠相比,大鼠更適合模擬人類的一些疾病,以及進(jìn)行營養(yǎng)學(xué),毒理和行為學(xué)的研究。然而受制于大鼠干細(xì)胞培養(yǎng)條件的苛刻性,近幾十年在基因操作領(lǐng)域的進(jìn)展大幅落后于小鼠。即便對于小鼠,由于傳統(tǒng)干細(xì)胞基因打靶技術(shù)其內(nèi)在的復(fù)雜性,也存在費(fèi)時(shí),困難,工作量大的問題,難以滿足日益增長的科研需求。隨著最近對黃單胞菌屬植物致病菌致病機(jī)理的破解,以及對細(xì)菌和古細(xì)菌抵抗噬菌體感染等外來遺傳物質(zhì)侵襲機(jī)制的揭示,基于轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白(transcription activator-like effector)的人工核酸酶TALEN (transcription activator-like effector nuclease)和改造自細(xì)菌獲得性免疫機(jī)制的CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種富有潛力的基因編輯工具進(jìn)入了人們的視線。為了證實(shí)以上技術(shù)是否能用于基因敲除大鼠及小鼠模型的構(gòu)建,我們針對位于8個(gè)染色體上共10個(gè)不同的小鼠基因,設(shè)計(jì)和組裝了相應(yīng)的TALEN表達(dá)質(zhì)粒,并通過將體外轉(zhuǎn)錄的TALEN mRNA顯微注射入小鼠受精卵。測序結(jié)果顯示,以上10個(gè)基因均成功獲得了突變體首建小鼠。新生小鼠中突變體小鼠的比例從13%到67%不等,平均突變效率約為40%。來自C57BL/6與FVB兩種不同遺傳背景的小鼠,在突變效率上沒有出現(xiàn)明顯的不同。所有進(jìn)行生殖系轉(zhuǎn)移能力測試的小鼠均能有效的將突變傳遞給子代小鼠。其中瘦素受體基因發(fā)生雙等位基因突變的F0代小鼠表現(xiàn)出了與之前報(bào)道相一致的肥胖和糖代謝紊亂等癥狀。另外我們通過向小鼠及大鼠受精卵細(xì)胞顯微注射體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA及靶點(diǎn)特異性guideRNA,證實(shí)CRISPR/Cas技術(shù)能夠在小鼠胚胎中產(chǎn)生高效的定點(diǎn)突變,并且沒有小鼠遺傳品系的限制。通過同時(shí)靶向Uhrf2基因兩個(gè)臨近的靶點(diǎn),表明CRISPR-Cas系統(tǒng)能夠?qū)Υ笃蔚幕蚪MDNA進(jìn)行刪除。通過在大鼠受精卵細(xì)胞注射針對Mc4r與Mc3r兩個(gè)不同基因的guideRNA,實(shí)現(xiàn)了在同一只大鼠中產(chǎn)生兩個(gè)基因突變的效果,且得到的Mc4r基因敲除大鼠與ENU化學(xué)誘變法構(gòu)建的同一基因突變大鼠相比具有一致的表型。通過對Th和Rheb基因兩種不同類型的潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行測序表明,CRISPR-Cas系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)具有較高的靶點(diǎn)特異性。生殖系轉(zhuǎn)移測試表明CRISPR-Cas造成的基因突變無論在大鼠還是小鼠中都能夠有效的遺傳給下一代。綜上所述,我們認(rèn)為TALEN和CRISPR系統(tǒng)可以作為繼干細(xì)胞基因打靶與鋅指核酸酶之后,更為優(yōu)越的基因敲除大、小鼠動(dòng)物模型構(gòu)建技術(shù)。能夠大大降低上述基因敲除動(dòng)物模型構(gòu)建的難度,費(fèi)用,周期,將極大的推動(dòng)基因敲除動(dòng)物模型在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：Q78;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 沈延;黃鵬;張博;;TALEN構(gòu)建與斑馬魚基因組定點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)方法與流程[J];遺傳;2013年04期

本文編號：2728477