【摘要】： 目的 血腦屏障(Blood Brain Barrier，BBB)是由內皮細胞的緊密連接，基膜及星形膠質細胞組成一個位于腦和微血管之間的物質調節(jié)界面，對進出的物質具有選擇性通過作用。血腦屏障的破壞是腦缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)腦損傷的重要的病理生理基礎。腦缺血再灌注早期，伴隨著細胞因子，粘附分子的表達，特別是促炎因子IL-1β、TNFα、IL-6、IL-8使缺血性損傷向炎癥性損傷轉變，其中抑制因子IL-10在IR損傷中也起到抵抗炎癥反應的作用。炎癥和免疫反應在腦缺血再灌注的病理生理中起重要作用，包括白細胞浸潤，巨噬細胞激活等。白細胞激活后產生大量的蛋白水解酶，氧自由基和其他效應分子，導致腦毛細血管內皮細胞及其基底膜損害，破壞BBB的完整性，導致BBB的通透性增加。高壓氧(hyperbaric oxygenation，HBO)作為治療缺血性腦血管疾病中的一種非創(chuàng)傷性手段在臨床上正得以應用。它具有改善組織缺氧，維持細胞能量代謝，減輕腦水腫作用，但HBO在腦缺血再灌注損傷中對血腦屏障通透性的影響研究甚少，本研究從細胞水平，分子水平，基因水平進一步探討高壓氧在腦缺血再灌注損傷中對血腦屏障通透性的影響，為臨床上應用高壓氧治療缺血性腦血管疾病提供有力的實驗依據(jù)。 方法 1．腦缺血再灌注模型的復制： 采用清醒小鼠頸部手術分離雙側頸總動脈，用橡皮泥固定拉緊絲線，阻斷雙側頸總動脈血流30分鐘，松線后，無菌縫合頸部皮膚。假手術組與HBO組只作頸部手術，不阻斷頸總動脈血流。 2．實驗鼠的高壓氧處理： 高壓氧組與高壓氧+腦缺血再灌注組于術后2h、9h、21h、45h、69h進入HBO艙內，待動物進艙后，先用純氧洗艙10分鐘，使艙內O_2濃度＞90％，加壓速率為0.0125MPa／min，加壓至0.25MPa，在高壓氧狀態(tài)下停留60分鐘，其間用純氧通氣10分鐘。停留畢，以20分鐘勻速減至常壓。 3．腦皮質血流檢測： 用激光多普勒血流儀監(jiān)測腦皮質血流，打開顱腔，選擇測定腦血流，于 缺血前、缺血10分鐘在0分鐘J0分鐘，再灌注4 ／J’時J ／J’時在3 ／J’時A8 ／J’時J72小時分別測定腦皮質血流值。 4．組織依文思蘭門vans blue，EB）定量測定： 參考 Udaka K．法。在處死動物前 1／J’時經尾靜脈注射 2％Evans蘭，在 檢測前20分鐘進行在體心臟灌注，直至心房流出清亮的液體為準。術后4 小時＊二小時上3小時／8小時 J72小時處死小鼠，摘取腦組織用電子天平 精確秤其濕重后，投入中號試管中，分別加人 3 ml甲酚胺，加蓋后于 45℃的 水浴箱孵育48h，輕輕搖勻，離心 15min門000r／min入取上清液在722型光 柵分光光度計比色h＝632urn八 5．ABC－ELISA法檢測細胞因子的含量： 術后72小時處死小鼠于冰盤上快速剝離腦部組織，以冰冷的PBS沖 洗，濾紙吸干，立即于電子天平秤重，配成 10％腦組織勻漿，勻漿液于 4T 4000r／ndn離心15分鐘，取上清液，采用雙抗體夾心ABC－ELISA法在波長 492urn處檢測 IL－16＼TNFa、IL－6、IL－8、IL－10的含量。 6．明膠酶譜法活力測定： 取海馬區(qū)的腦組織經勻漿離心制成蛋白質抽提液，取ZOUI上樣于含 sing／Inl明膠的聚丙烯酚胺凝膠中，20mA恒流電泳，電泳后，將凝膠于 2． 5％的TitonX－100液內振蕩37℃，1／J’時，酶緩沖液K，PH7． 5；200mmoUINaCI；500nunol／ICaCI。吶乒育 37℃，42小日。多育結束后經染 色液”．05％考馬斯亮藍乃0％甲醇＊0％乙酸）染色3小時，及脫色液A。 B人（甲醇濃度為30％上0％J0％；乙酸濃度分別為10％＊0％J％）分別 脫色0．5、l上／J’時顯示出MMP－2和MMP－9位于藍色背景上的透亮帶。 7．抗氧化酶類（GSH－PX3OD人AT）及NOS活性和丙二醛（MDA）含 量的測定：于再灌注72小時處死小鼠，于冰盤上取海馬區(qū)的腦組織，置勻漿 管中，加人預冷的生理鹽水若干毫升，用勻漿器制成10％的勻漿，用臺式高 速離心機LJ 10000r／min離心 smin取上清液。用 NOS、GSH－PX、SOD。 CAT、MDA測試盒分別在入二530urn、入＝412urn、入＝550urn、入＝405urn及A 二 532urn處檢測酶活性及丙H醛的含量。 8．RT－PCR法檢測腦組織中細胞因子的表達 ·2· 8l 腦組織總RNA抽提：同異硫氰酸肥‘一步法”提取。取海馬區(qū)腦 組織0．1克量／rnl TRIzol中于冰上勻漿后，放置10min，取上清加氯仿 200ul，輕搖混勻，4℃離心 10000rpln／min 15min后，取上清液加 500rpl異丙 醇，室溫下放置 15min，4℃離心 12000rpln／min 15min，棄上清加乃％乙醇 IM，4℃離心12000rpndmin 15min。室溫干燥，加無RNA酶水溶解。電泳 掃描檢測RNA含量，置－70℃保存。 8．2 RT—PCR反應： 采用 RT－PCR法對腦缺血再灌注小鼠幾－16、TNFa、IL－6、IL－8、IL 叫0的mRNA的表達水平進行檢測及半定量分析。 弓物序列女下： IL－二 p：PI：5’－GAGA’ITG�。蹽CTGTCTGCT－3’， PZ：5’－AAGGAGAACCAAGCAACGAC—3二313 hp， TNFa：PI：5’－CAGATI’GACCTCAGCG
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R363
【圖文】：

線粒體晴斷裂。Fi妙Eleetronmieroseopie沮showinIR卿up3.2HBO十腦缺血再灌注組與腦缺血的再灌注組相比(見圖5)神經元壞死不明顯，膠質細胞內胞漿淡染，胞核明顯，線粒體結構清晰，峪明顯。

【參考文獻】

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本文編號：2727927