【摘要】： 第一章S.j童蟲細(xì)胞不同大小和不同途徑免疫小鼠抗攻擊感染的研究 目的觀察三種品系小鼠對日本血吸蟲(S.j)易感性及致病性的差異,比較S.j肝期童蟲不同大小的細(xì)胞及肝期童蟲混合細(xì)胞皮下和靜脈注射兩種免疫途徑的保護(hù)性效果差異,探索不同發(fā)育期童蟲細(xì)胞聯(lián)合免疫提高保護(hù)性效果的可能性。 方法KM鼠、NIH鼠、BALB/c鼠各10只,感染S.j尾蚴30±1尾/只,感染后第44d剖殺,觀察各組小鼠的成蟲發(fā)育率、肝卵數(shù)、肝卵肉芽腫及抗體應(yīng)答水平;取S.j肝期童蟲用剪切+冷消化法制備細(xì)胞,采用不同離心力將肝期童蟲混合細(xì)胞分為大、中、小三類;取尾蚴熱脫尾法收集皮膚期童蟲,其中一部分培養(yǎng)96h后獲取肺期童蟲,兩種童蟲均用勻漿法制備細(xì)胞。保護(hù)性實驗設(shè)計:取70只KM鼠,隨機(jī)分組分為A(PBS對照)、B(HSMegCs)、C(HSMedCs)、D(HSMiniCs)、E(DSCs+PSCs+HSCs聯(lián)合免疫)、F(HSCs-s.c.)和G(HSCs-i.v.)7組;免疫接種途徑,除G組為尾靜脈注射外,其余各組均為皮下多點注射;細(xì)胞接種量,均為2×10~6/0.1ml/次/鼠,每隔2w免疫1次,共免疫3次;末次免疫后2w攻擊感染S.j尾蚴30±1尾/鼠,攻擊后第44d剖殺,觀察各組小鼠平均蟲荷數(shù),每克肝卵數(shù)(LEPG),每對蟲肝卵數(shù)(LEPWP)、肝卵肉芽腫大小及血清特異性抗體水平。 結(jié)果KM鼠、NIH鼠和BALB/c鼠體內(nèi)S.j成蟲發(fā)育率分別為69.23%,64.0%和50.33%,后者與前二者比較,有顯著性差異(P＜0.05),前二者間比較,差異無顯著性(P＞0.05);LEPG、LEPWP、肝卵肉芽腫及特異性抗體水平在三種小鼠間差異也無顯著性(P＞0.05)。保護(hù)性實驗結(jié)果顯示:與A組相比,B組、C組、D組、E組、F組和G組的減蟲率分別為15.08%、7.13%、16.4%、18.23%、31.02%和42.12%,LEPG減少率分別為14.56%、15.61%、13.53%、14.33%、41.61%和55.36%,LEPWP減少率分別為9.00%、8.38%、0.91%、0.15%、32.89%和27.84%。統(tǒng)計學(xué)分析表明,與A組相比,B組、C組、D組和E組的減蟲率、LEPG減少率和LEPWP減少率的差異均無顯著性(P＞0.05),而F組和G組的減蟲率、LEPG減少率、LEPWP減少率及蟲卵肉芽腫面積減少率的差異有顯著性(P＜0.01或P＜0.05)。F組和G組比較,減蟲率和LEPG的差異有顯著性(P＜0.01),但LEPWP及蟲卵肉芽腫面積減少率的差異無顯著性(P＞0.05)。 結(jié)論KM鼠在對S.j易感性和致病性方面與NIH鼠,BALB/c無明顯差異;S.j肝期童蟲混合細(xì)胞采用靜脈免疫途徑的效果最佳;用不同大小的細(xì)胞免疫或不同發(fā)育期童蟲細(xì)胞聯(lián)合免疫的保護(hù)性效果不僅不能得到改善反而會降低。 第二章S.j細(xì)胞型免疫原模擬表位的免疫學(xué)鑒定和保護(hù)性研究 目的了解S.j童蟲細(xì)胞免疫血清對噬菌體展示肽庫進(jìn)行親和篩選所獲得的模擬表位的免疫原性和免疫保護(hù)性效果。 方法用S.j 12d童蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞免疫小鼠,獲得具有抗攻擊感染保護(hù)力的免疫血清并對噬菌體隨機(jī)12肽庫進(jìn)行4輪親和篩選;隨機(jī)挑選20個克隆進(jìn)行檢測,并對15個陽性克隆進(jìn)行DNA測序和生物信息學(xué)分析;將單個和混合陽性克隆分別免疫小鼠,用ELISA和Western blot鑒定陽性克隆的免疫原性及是否為血吸蟲細(xì)胞免疫原的模擬表位;將含精氨酸殘基克隆(PC-R)和不含精氨酸殘基克隆(PC-NR)分別免疫KM鼠,同時設(shè)M13噬菌體免疫組和12d童蟲細(xì)胞(SCs-12)免疫組,隔周免疫1次,共免疫3次,末次免疫后兩周攻擊感染S.j尾蚴40±1尾/鼠,攻擊后第42d剖殺小鼠,計算各組蟲荷和肝卵荷。 結(jié)果15個陽性克隆經(jīng)DNA測序和生物信息學(xué)分析顯示其中有12個克隆具有完全不同的序列,且與已知日本血吸蟲基因序列之間無同源性。12個克隆中有8個克隆含精氨酸殘基。ELISA檢測結(jié)果顯示:SCs-12抗血清能與12個克隆中的11個發(fā)生反應(yīng);12個克隆的免疫鼠血清,除Clone-6,9外,均與JWA-12抗原呈陽性反應(yīng)。Western blot顯示Clone7,5,19,20免疫血清能識別JWA-12;保護(hù)性實驗結(jié)果顯示:與對照組相比,PC-R和PC-NR的減蟲率和LEPG差異均有顯著性(P＜0.01),PC-R和PC-NR兩組間差異無顯著性(P＞0.05)。 結(jié)論噬菌體隨機(jī)肽庫篩出日本血吸蟲童蟲細(xì)胞抗原模擬表位,并可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的抗攻擊感染效果。 第三章S.j童蟲細(xì)胞膜單克隆抗體的制備 目的篩選鑒定出一種S.j童蟲細(xì)胞膜的單克隆抗體,為血吸蟲細(xì)胞生物學(xué)及免疫學(xué)研究提供工作基礎(chǔ)和工具。 方法感染家兔獲取日本血吸蟲肝門期童蟲,用剪切+冷消化法制備細(xì)胞,用膜蛋白提取試劑盒提取血吸蟲童蟲細(xì)胞膜蛋白,然后用獲得的膜蛋白腹腔注射免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,ELISA檢測鼠血清中抗體水平達(dá)到1:4000,將小鼠在無菌條件下剖殺,取其脾細(xì)胞與預(yù)備的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,于96孔板中用含HAT和HT的培養(yǎng)基對融合細(xì)胞進(jìn)行選擇培養(yǎng),用提取的膜蛋白抗原采用ELISA檢測每孔培養(yǎng)細(xì)胞的上清是否含有陽性抗體,對陽性孔的細(xì)胞進(jìn)行亞克隆培養(yǎng)并檢測篩選,共進(jìn)行了3次亞克隆培養(yǎng)與篩選。 結(jié)果篩選所得到的陽性克隆在亞克隆的過程中細(xì)胞逐漸死亡或者轉(zhuǎn)為陰性細(xì)胞,最后實驗失敗,未獲得單克隆細(xì)胞株。 結(jié)論未能制備出穩(wěn)定分泌針對S.j童蟲細(xì)胞膜抗原的單克隆抗體,可能與SP2/0細(xì)胞突變有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392
【圖文】：

圖Figl一32.3特異性抗體水平差異用間接ELISA法檢測三種小鼠不同時點血清中抗HSSAgIgG抗體水平結(jié)果見表卜4和圖卜4。由表中可看出，IgG水平在成蟲期上升的最快，三種小鼠之間的IgG水平在各時點無明顯差異，說明KM鼠對血吸蟲抗原刺激后的免疫應(yīng)

Flgurel礴anti、 HSSAgIgGlevelofthreestrainmieeatdifferentt如 eafterinfection2.4Sj童蟲細(xì)胞免疫原形態(tài)、活力和種屬鑒定收集的皮膚期和肺期童蟲細(xì)胞的蟲體圖片見圖1一5。皮膚期童蟲和肺期童蟲經(jīng)研磨洗滌離心得到細(xì)胞，肝期童蟲經(jīng)機(jī)械剪切和胰酶消化后，洗滌離心得到細(xì)胞，如圖1一6所示，細(xì)胞絕大多數(shù)呈圓形，表面光滑，飽滿，輪廓清晰，有清晰的胞核和核仁，細(xì)胞間雜質(zhì)少。AO一EB染色顯示細(xì)胞活力在90%左右，見圖1一7。

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1 李艷琴;日本血吸蟲童蟲細(xì)胞免疫原及其模擬表位免疫學(xué)特性的研究[D];中南大學(xué);2008年

本文編號：2727334