【摘要】：N7-鳥甘甲基化的帽子(cap)是真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)特征。大多數(shù)在細胞質(zhì)中復(fù)制的真核細胞的病毒,包括冠狀病毒,已經(jīng)進化為對自身RNA進行加帽修飾。在以前的研究中,我們通過一個酵母遺傳系統(tǒng),來篩選嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)冠狀病毒編碼的形成帽子的酶,發(fā)現(xiàn)冠狀病毒SARS的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp14,在酵母細胞內(nèi)和通過純化的酶和RNA底物的體外環(huán)境中,行使N7鳥甘甲基轉(zhuǎn)移酶(N7-MTase)的功能。冠狀病毒的nsp14曾被證明具有3’-5’的核酸外切酶活性。通過序列比對后,發(fā)現(xiàn)nsp14在結(jié)構(gòu)上具有細胞N7-MTase保守特征。經(jīng)突變分析,我們發(fā)現(xiàn)N7-甲基轉(zhuǎn)移酶活性位于nsp14的C端部分上。對于N7-甲基轉(zhuǎn)移酶活性而言,核酸外切酶活性位點不是必需的,但是需要核酸外切酶的結(jié)構(gòu)域。這兩個功能域的組合共同位于冠狀病毒nsp14上,說明它可能代表一種新型的RNA加工酶。 冠狀病毒編碼N7甲基酶和2’-O-甲基酶(2'-O-MTase),其基因組RNA和亞基因組RNA的5’端在病毒兩種甲基轉(zhuǎn)移酶的連續(xù)作用下,形成I型帽子結(jié)構(gòu)的。冠狀病毒的N7-MTase很特別,它與核酸外切酶(ExoN)共同位于冠狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp14。在本研究中,通過對SARS冠狀病毒的nsp14進行缺失和點突變,研究N7-MTase的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。結(jié)果表明,冠狀病毒的N7-MTase不同于其他病毒,即其他病毒的N7-甲基轉(zhuǎn)移酶與在同一個多肽上的其他功能結(jié)構(gòu)域是分開的,冠狀病毒的核酸外切酶的功能域則密切參與行使N7-甲基轉(zhuǎn)移酶的功能。通過酵母菌遺傳系統(tǒng)和體外生化實驗一共鑒定出對N7-MTase至關(guān)重要的12個關(guān)鍵氨基酸殘基,其中兩個位于N端核糖核酸外切酶中心區(qū)域的殘基,對具有N7-甲基轉(zhuǎn)移酶酶功能是必須的,更說明了ExoN區(qū)域在N7-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的重要作用。其他10個重要氨基酸分布在整個nsp14的N7-甲基轉(zhuǎn)移酶區(qū)域,不過大多位于nsp14的甲基化酶的S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的結(jié)合位點和甲基化酶蛋白結(jié)構(gòu)折疊的的重要區(qū)域上。分析結(jié)果顯示,nsp14基序DxGxPxA(氨基酸[aa]331～338)被認為是SAM的結(jié)合位點的中心位置。這些結(jié)果揭示了冠狀病毒nspl4的N7-甲基轉(zhuǎn)移酶的復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。 復(fù)制系統(tǒng)的突變分析顯示,N7-甲基轉(zhuǎn)移酶的活性對SARS病毒的復(fù)制轉(zhuǎn)錄很重要,因此該病毒蛋白可望作為抗SARS冠狀病毒治療的的一個藥物靶點。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R373

【共引文獻】

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本文編號：2726854