【摘要】：神經(jīng)病理性痛是一種影響人類(lèi)健康的頑疾，長(zhǎng)期困擾患者并嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，其對(duì)于健康的危害程度不亞于腫瘤。在痛覺(jué)信息傳遞過(guò)程中，中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(periaqueductal gray，PAG)是中樞下行痛覺(jué)調(diào)制系統(tǒng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其中中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)腹外側(cè)區(qū)(ventrolateral periaqueductal gray，vlPAG)是機(jī)體對(duì)傷害性信息進(jìn)行自身調(diào)制或整合的重要位點(diǎn)，它可被發(fā)自脊髓和延髓的第二級(jí)感受傷害性刺激的神經(jīng)元激活，將傷害性信息投射至更高級(jí)中樞，進(jìn)而對(duì)傷害性信息進(jìn)行處理。同時(shí)，vlPAG也發(fā)出纖維加入下行調(diào)制系統(tǒng)，參與對(duì)延髓和脊髓背角內(nèi)上行性傷害性信息傳遞的調(diào)控。因此，研究vlPAG腦區(qū)參與疼痛調(diào)控的作用機(jī)制，有助于了解神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生和維持的機(jī)制。以往研究表明，分布在外周及脊髓背角的超極化激活-環(huán)核苷酸門(mén)控的陽(yáng)離子通道（hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated cation channels，即“HCN通道”）的異�；罨鸬纳窠�(jīng)元異位放電是神經(jīng)病理性痛產(chǎn)生和持續(xù)的重要因素，部分結(jié)果提示HCN通道阻斷劑可能通過(guò)抑制脊髓以上的中樞發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。vlPAG腦區(qū)可見(jiàn)HCN1和HCN2通道表達(dá)分布，但目前對(duì)于vlPAG腦區(qū)HCN通道參與神經(jīng)病理性痛的發(fā)病機(jī)制尚需深入探討。 HCN通道家族成員是上世紀(jì)90年代被克隆出，該家族由HCN1、2、3和4四個(gè)亞型組成，廣泛分布在心血管和神經(jīng)系統(tǒng)，其電生理功能的多樣性一直吸引著眾多研究者的目光。HCN通道最主要的特性就是通過(guò)調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞膜生物學(xué)特性影響神經(jīng)元的興奮性及突觸信息傳遞。研究表明，HCN通道是調(diào)控心血管及神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要因素，在一系列以神經(jīng)系統(tǒng)興奮性異常改變?yōu)樘攸c(diǎn)的疾�。ㄈ绨d癇、腦缺血及神經(jīng)病理性痛的研究）中，均檢測(cè)到HCN通道功能發(fā)生異常改變。目前認(rèn)為HCN通道，特別是HCN2通道在炎性痛和病理性痛中表達(dá)升高，激活速度加快，促進(jìn)外周異位放電的形成；敲除HCN2基因之后能夠明顯抑制異位放電及緩解疼痛癥狀，且不影響動(dòng)物的正常感覺(jué)及痛閾。這提示HCN通道異常改變?cè)谏窠?jīng)病理性痛的起始及維持中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也提示cAMP信號(hào)途徑在病理性痛發(fā)生及維持中發(fā)揮很重要的作用，但迄今為止對(duì)于vlAPG區(qū)HCN通道在神經(jīng)病理性痛發(fā)病中的作用尚缺乏研究。我們推測(cè)在神經(jīng)病理性痛過(guò)程中vlPAG腦區(qū)HCN通道可能出現(xiàn)表達(dá)、功能變化，使某些類(lèi)型神經(jīng)元電活動(dòng)發(fā)生改變，進(jìn)而參與或者誘導(dǎo)了病理性痛相關(guān)疾病癥狀的發(fā)生及維持。 本課題擬通過(guò)坐骨神經(jīng)CCI (chronic constriction injury)手術(shù)制備神經(jīng)病理性痛動(dòng)物模型，運(yùn)用形態(tài)學(xué)、電生理以及行為學(xué)技術(shù)，研究vlPAG腦區(qū)HCN通道在神經(jīng)病理性痛調(diào)控中的作用；通過(guò)在體行為學(xué)及離體電生理實(shí)驗(yàn)，研究HCN通道抑制劑參與鎮(zhèn)痛的具體分子及電生理機(jī)制；并以cAMP信號(hào)途徑為切入點(diǎn)，初步探討病理性痛過(guò)程中vlPAG腦區(qū)HCN通道功能改變的調(diào)控機(jī)制，為治療神經(jīng)病理性疼痛提供深入的理論基礎(chǔ)。 方法： 1.通過(guò)坐骨神經(jīng)CCI手術(shù)制備大鼠神經(jīng)病理性痛模型，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、免疫組織化學(xué)染色和Western blot定量觀察vlPAG腦區(qū)CCI術(shù)后HCN1和HCN2通道m(xù)RNA水平和蛋白的表達(dá)及分布改變； 2.制備vlPAG腦內(nèi)置管后的CCI大鼠模型，注射HCN通道阻斷劑后，通過(guò)熱輻射法和Von Frey(vFh)纖維絲檢測(cè)大鼠熱痛閾和機(jī)械性痛閾的變化； 3.腦片全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察記錄正常及CCI組腦組織片vlPAG腦區(qū)神經(jīng)元的HCN通道電流及神經(jīng)興奮性的變化情況。通過(guò)Biocytin標(biāo)記對(duì)腦組織片vlPAG腦區(qū)記錄細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。 4.應(yīng)用“胞內(nèi)cAMP檢測(cè)試劑盒”檢測(cè)正常及CCI組vlPAG腦區(qū)組織胞內(nèi)cAMP水平的差異，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察記錄腦組織片vlPAG腦區(qū)神經(jīng)元在分別給予AC激動(dòng)劑FSK和HCN通道抑制劑后神經(jīng)元興奮性的變化。 結(jié)果： 1．成功制備了大鼠坐骨神經(jīng)CCI神經(jīng)病理性痛的動(dòng)物模型，CCI術(shù)后大鼠熱痛閾和機(jī)械性痛閾均顯著降低，術(shù)后14d最明顯，假手術(shù)組大鼠痛閾未見(jiàn)明顯變化。CCI組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能未受影響，與假手術(shù)組和正常組大鼠相比較無(wú)顯著差異。 2．實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示大鼠CCI術(shù)后14d，其vlPAG腦區(qū)HCN1和HCN2通道m(xù)RNA水平均顯著上調(diào)；免疫組織化學(xué)和Western blot結(jié)果顯示大鼠CCI術(shù)后14d，vlPAG腦區(qū)HCN1通道和HCN2通道蛋白表達(dá)顯著增加，神經(jīng)元胞膜表達(dá)顯著升高，且陽(yáng)性神經(jīng)元比例顯著升高。 3. vlPAG腦區(qū)微量注射生理鹽水后CCI大鼠的熱痛閾和機(jī)械性痛閾均未發(fā)生明顯變化；給予ZD7288后的CCI大鼠其損傷同側(cè)后肢熱痛閾和機(jī)械性痛閾明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HCN通道阻斷劑ZD7288的鎮(zhèn)痛效應(yīng)具有劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性，劑量越高效果越明顯，且效果雖注射后時(shí)間迅速升高，而后逐漸降低。vlPAG腦區(qū)注射生理鹽水或ZD7288對(duì)正常及模型動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能無(wú)顯著影響。 4.全細(xì)胞膜片鉗記錄顯示vlPAG腦區(qū)一類(lèi)神經(jīng)元具有HCN通道電流特性。與假手術(shù)對(duì)照組相比較，CCI組大鼠術(shù)后14d vlPAG腦區(qū)神經(jīng)元HCN電流顯著增強(qiáng)，激活曲線(xiàn)向去極化偏移，神經(jīng)元興奮性增加。應(yīng)用ZD7288阻斷HCN通道后，神經(jīng)元興奮性顯著降低。Biocytin標(biāo)記顯示所記錄細(xì)胞位于vlPAG腦區(qū)。 5.胞內(nèi)cAMP檢測(cè)結(jié)果顯示CCI組的vlPAG腦區(qū)cAMP水平顯著高于假手術(shù)對(duì)照組。全細(xì)胞膜片鉗記錄顯示正常大鼠腦組織孵育AC激動(dòng)劑后升高胞內(nèi)cAMP水平后vlPAG腦區(qū)神經(jīng)元興奮性顯著增強(qiáng)，同時(shí)應(yīng)用HCN通道阻斷劑ZD7288后，神經(jīng)元興奮性回落至接近正常水平。 結(jié)論： 1.神經(jīng)病理性痛大鼠vlPAG腦區(qū)HCN1和HCN2通道表達(dá)水平發(fā)生改變，與神經(jīng)病理性痛的發(fā)生及維持相關(guān)。 2.神經(jīng)病理性痛大鼠vlPAG腦區(qū)Ih電流增強(qiáng)后參與調(diào)控神經(jīng)元興奮性改變，進(jìn)而參與神經(jīng)病理性痛的維持。 3.神經(jīng)病理性痛發(fā)病過(guò)程中cAMP信號(hào)途徑發(fā)揮重要的調(diào)控作用，cAMP通過(guò)調(diào)控vlAPG區(qū)某一類(lèi)神經(jīng)元HCN通道的功能，影響神經(jīng)元興奮性，使vlPAG發(fā)揮下行易化作用，參與神經(jīng)病理性痛的發(fā)生及維持。 4.抑制vlAPG區(qū)HCN通道功能能夠緩解神經(jīng)病理性痛癥狀。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R363
【圖文】：

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 變化，Western blot 條帶結(jié)果顯示，大鼠 CCI 術(shù)后 14d，vlPAG 腦區(qū) HCN1 N2 通道總蛋白表達(dá)水平均顯著增加，通過(guò) GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)化后統(tǒng)計(jì)學(xué)比較發(fā)現(xiàn)照組及假手術(shù)組大鼠有顯著差異 (HCN1: F(2,15)=300.01, p <0.001, HC)=358.31, p <0.001) (Figure 3)。熒光實(shí)時(shí)定量 PCR (Realtime-PCR) 技術(shù)進(jìn)一I 后大鼠 vlPAG 腦區(qū) HCN1 和 HCN2 通道 mRNA 的變化情況，結(jié)果顯示：與組大鼠相比，模型組大鼠 CCI 術(shù)后 14d vlPAG 腦區(qū) HCN1 和 HCN2 型通道 mR平顯著升高 (p＜0.01，n=6) (Figure 4)。為了進(jìn)一步檢測(cè) HCN1 和 HCN2 通lAPG 腦區(qū)神經(jīng)元的表達(dá)分布特點(diǎn)，我們進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，免疫組化一步表明坐骨神經(jīng) CCI 手術(shù)后大鼠 vlAPG 腦區(qū) HCN1 和 HCN2 通道陽(yáng)性細(xì)高，半定量后與假手術(shù)組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (p＜0.01，n=6) (Figure 5)，熒光染色后激光共聚焦掃描發(fā)現(xiàn)，vlPAG 腦區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞膜 HCN1 通道和 H白表達(dá)均明顯增高 (Figure 6)。

圖 5 免疫組化檢測(cè) CCI 術(shù)后 vlPAG 腦區(qū) HCN1 通道和 HCN2 通道表達(dá)變化Figure 5 HCN1 and HCN2 expression are increased in vlPAG neurons after CCI surgerymmunohistochemical visualization of HCN1, 2 - immunoreactivities (IR) neurons in simultased CCI and sham vlPAG is shown. Note increases of HCN1- and HCN2- IR in CCI vlPAGranes. Histogram presents the mean numbers of HCN1, 2- IR neurons per section in vlPAG, rease in CCI than sham control. Scale bar, 100μm. (n = 6, * p < 0.05, compared to Sham con36

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本文編號(hào)：2725951