發(fā)布時間：2020-06-22 16:42

【摘要】：背景：SARS的感染是由SRAS-CoV引起的。SARS-CoV共有四種結(jié)構(gòu)蛋白，S蛋白是冠狀病毒表面最大的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合及介導(dǎo)膜融合并進(jìn)入細(xì)胞的過程中起關(guān)鍵性作用。既往對冠狀病毒S蛋白的研究表明，S蛋白是SARS-CoV與宿主細(xì)胞膜受體的結(jié)合部位，包含重要的中和抗原表位，是進(jìn)行抗SARS疫苗設(shè)計(jì)的重要位點(diǎn)。S蛋白突變率較低的冠狀病毒，通過S蛋白已經(jīng)獲得了有效的疫苗。SARS-CoV的S蛋白的氨基酸突變率不高，通過S蛋白很有希望獲得有效抗的SARS疫苗。 目的：本實(shí)驗(yàn)將根據(jù)SARS-CoV S蛋白的序列，通過網(wǎng)絡(luò)共享軟件對S蛋白的二級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和S蛋白的抗原表位進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測與分析，并根據(jù)預(yù)測結(jié)果設(shè)計(jì)并合成出一系列的候選抗原表位多肽進(jìn)行免疫學(xué)研究。通過將合成的抗原表位多肽與SARS康復(fù)病人的血清反應(yīng)，以及在動物體內(nèi)的免疫反應(yīng)，以發(fā)現(xiàn)S蛋白的抗原表位，從而為基于S蛋白的亞單位疫苗深入研究打下基礎(chǔ)。 方法：利用Expasy提供的網(wǎng)絡(luò)共享工具軟件Proteomics and sequence analysis tools對S蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，信號肽切割位點(diǎn)，穿膜螺旋，N-糖基化位點(diǎn)，O-磷酸化位點(diǎn)，半光氨酸結(jié)合狀態(tài)，親水性，可及性，β-轉(zhuǎn)角進(jìn)行預(yù)測。利用http//mif.dfci.harvard.edu提供的PREDICTING ANTIGENIC PEPTIDES軟件對B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測。利用http://www.imtech.res.in/提供的軟件nHLAPred和ProPre分別進(jìn)行MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ限制性的T細(xì)胞抗原表位預(yù)測。根據(jù)B細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)果設(shè)計(jì)并合成抗原表位多肽�？乖砦欢嚯牟捎肍moc-butyl固相合成側(cè)鏈保護(hù)策略，在多肽合成儀上進(jìn)行合成，HPLC進(jìn)行純化，電噴霧電離法(electrospray ionization source，ESI)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定�？乖� 第一軍醫(yī)大學(xué)博士論文 位多膚采用間接ELISA法測定SARS相關(guān)冠狀病毒抗原表位膚與SARS 病人血清中抗體的反應(yīng)。根據(jù)抗體反應(yīng)呈陽性的抗原表位多膚，綜合S 蛋白的二級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)及T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測與分析結(jié)果，設(shè)計(jì) 并合成新的抗原多膚。綜合設(shè)計(jì)的抗原多膚采用皮下注射的方式對新西 蘭家兔進(jìn)行免疫。用間接ELISA法檢測免疫家兔產(chǎn)生抗體的滴度。 結(jié)果:預(yù)測結(jié)果表明，在S蛋白中存在一個球狀結(jié)構(gòu)區(qū)域(Sl區(qū)) 和三個螺旋區(qū)( 52區(qū))，螺旋結(jié)構(gòu)分別位于殘基729一769，880一1015， 1163一1184。S蛋白的信號膚切割位點(diǎn)位于N一端的13位氨基酸殘基(Gly) 和14位氨基酸(Ser)殘基之間。S蛋白在11%一1218之間存在一段穿膜 螺旋結(jié)構(gòu)，1一1 195段處于胞膜外，1219一1255則在胞膜內(nèi)。S蛋白共 有23個糖基化位點(diǎn)，其中有10個糖基化的可能性很高，7個糖基化程 度一般，6個糖基化程度較低。S蛋白共有196個O一磷酸化位點(diǎn)，包括 96個Ser和100個Thr的磷酸化位點(diǎn)。所有這些位點(diǎn)磷酸化的可能性都 不高。s蛋白的39個cys中只有4個形成二硫鍵的可能性高。它們分別 是255，725，731，522位的eys。s蛋白共存在10個暴露的片段，即 75一95，303一338，372一393，451一478，481一515，610一642，657 一690，789一825，1095一1140，1202一1242。S蛋白主要有七個親水性 較高的區(qū)域，即166一212，260一348，367一470，507一572，749一772， 1118一1152，1229一1252。S蛋白在殘基459一470存在明顯的日一轉(zhuǎn)角。 T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測結(jié)果表明，共有11個膚段被預(yù)測為HLA一I分子 的混雜性抗原表位，共有9個膚段被預(yù)測為HLA一11分子的混雜性抗原表 位，共有7個九膚段被預(yù)測為HLA一A2特異性抗原表位。B細(xì)胞抗原 表位預(yù)測結(jié)果表明，S一蛋白共存在氨基酸殘基數(shù)目不小于7的抗原表位 位點(diǎn)61個。根據(jù)B細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)果共設(shè)計(jì)出47個抗原表位多膚， 并合成了35個抗原表位多膚。用ELISA檢測，有六個抗原表位多膚與 SARS康復(fù)病人血清反應(yīng)呈陽性結(jié)果，即S一7、S一14、S一17、S一20、N一5 第一軍醫(yī)大學(xué)博士論文 和N一19。綜合設(shè)計(jì)的抗原多膚SV一1和SV一5在家兔體內(nèi)產(chǎn)生了較強(qiáng)的免 疫反應(yīng)，其免疫后的家兔血清可以檢測到SV一1和SV一5的特異性抗體。 SV-7和SV- 10產(chǎn)生的免疫反應(yīng)很弱。 結(jié)論:預(yù)測和分析了SARS一CoVS蛋白的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及B 細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位，有助于提高尋找S蛋白的抗原表位的 效率。設(shè)計(jì)并合成了35個S蛋白的B細(xì)胞抗原表位多膚，并進(jìn)行了純 化和結(jié)構(gòu)確證，為發(fā)現(xiàn)S蛋白的抗原表位提供了一定的物質(zhì)條件。發(fā)現(xiàn) 了6個S蛋白B細(xì)胞的抗原表位多膚與SARS康復(fù)病人血清反應(yīng)呈陽 性，并發(fā)現(xiàn)S蛋白的兩個抗原多膚片段在家兔體內(nèi)能夠產(chǎn)生其特異性抗 體，為抗SARS多膚疫苗的深入研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392
【圖文】：

人的上呼吸道感染。其中S蛋白的功能差異值得進(jìn)一步研究。2.信號膚切割位點(diǎn)及穿膜螺旋預(yù)測信號膚切割位點(diǎn)及穿膜螺旋預(yù)測在httP洲~.cbs.dtu.胡services上進(jìn)行。信號膚切割位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果見圖1。預(yù)測結(jié)果表明，S蛋白的信號膚切割位點(diǎn)位于N一端的13位氨基酸殘基(Gly)和14位氨基酸(Ser)殘基之間。穿膜膚的預(yù)測結(jié)果見圖2。結(jié)果表明S蛋白在11%一1218之間存在一段穿膜螺旋結(jié)構(gòu)。1一1195段處于胞膜外，1219一1255則在胞膜內(nèi)。

切割位點(diǎn)位于N一端的13位氨基酸殘基(Gly)和14位氨基酸(Ser)殘基之間。穿膜膚的預(yù)測結(jié)果見圖2。結(jié)果表明S蛋白在11%一1218之間存在一段穿膜螺旋結(jié)構(gòu)。1一1195段處于胞膜外，1219一1255則在胞膜內(nèi)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 肖露露,陳洪濤,葉欣,馬琳雅,譚茵,張升;HLA多態(tài)性在廣東漢族人群分布的特殊性[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1999年04期

本文編號：2725948