【摘要】：1973年,西雅圖的研究人員Jones和Smith公布了一系列孕期酒精暴露相關(guān)癥狀的研究結(jié)果,并將其正式命名為胎兒酒精中毒綜合癥(Fetal Alcohol Syndrome, FAS)。自此以后,越來(lái)越多的研究者加入到孕期酒精暴露引起的胎兒出生缺陷的研究中。在機(jī)制方面,關(guān)于胎兒酒精中毒綜合征的遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)機(jī)制也有越來(lái)越多的報(bào)道。相比之下,男性長(zhǎng)期酗酒導(dǎo)致后代出生缺陷的研究卻極少。在有限的動(dòng)物學(xué)研究中,由于酒精量、年齡及品種的差異,酒精導(dǎo)致雄性小鼠后代出生缺陷的表型不一,機(jī)制研究尚未涉及。盡管人們猜測(cè),酒精作為環(huán)境致畸因子可能通過(guò)表觀遺傳學(xué)改變而致使后代發(fā)生出生缺陷,但迄今為止,父系酒精暴露導(dǎo)致胎兒酒精綜合癥的表觀遺傳學(xué)機(jī)制卻鮮有報(bào)道。本研究擬從表觀遺傳學(xué)角度將酒精導(dǎo)致精子異常與后代出生缺陷相聯(lián)系,先建立雄性動(dòng)物長(zhǎng)期酒精暴露導(dǎo)致的后代出生缺陷模型,再通過(guò)各種表觀遺傳學(xué)分析技術(shù)檢測(cè)父本精子以及后代各組織的表觀遺傳修飾變化,以回答酒精究竟是否可以通過(guò)父系精子的表觀遺傳學(xué)變異導(dǎo)致后代發(fā)生出生缺陷這個(gè)關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題,并力爭(zhēng)明確部分分子機(jī)制。本研究分為以下四個(gè)部分：一、通過(guò)對(duì)雄性KM,C57及Aldh2-/-小鼠進(jìn)行為期1個(gè)月的梯度酒精(0g/kg,1g/kg和3.3g/kg)灌胃處理,檢測(cè)小鼠體重、睪丸重量、附睪重量、精子密度以及精子活力等參數(shù),對(duì)不同雄性小鼠長(zhǎng)期酒精暴露對(duì)其生殖毒性影響進(jìn)行研究。二、三種實(shí)驗(yàn)小鼠與正常雌鼠雜交,獲得F1代小鼠,通過(guò)對(duì)其存活率、畸形率、體重及性別比統(tǒng)計(jì)觀察F1代小鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況;待F1代小鼠8周齡后,對(duì)其進(jìn)行高架十字、懸尾實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn),對(duì)其焦慮抑郁情緒及認(rèn)知能力進(jìn)行評(píng)測(cè)。三、通過(guò)MassArray EpiTYPER甲基化平臺(tái),對(duì)酒精處理KM小鼠FO代精子、F1和F2代大腦皮層4個(gè)印跡基因(H19, Peg3, Ndn及Snrpn) DMR區(qū)的甲基化水平進(jìn)行研究,并用QRT-PCR檢測(cè)其大腦皮層中mRNA水平表達(dá)情況。四、使用酶切甲基化測(cè)序(MSCC)方法對(duì)酒精處理的C57小鼠F0代精子和F1代海馬組織進(jìn)行全基因組DNA甲基化分析,再利用表達(dá)譜芯片對(duì)F1代海馬組織進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檢測(cè),最后用生物信息學(xué)進(jìn)行分析和篩選,挑選酒精處理后C57小鼠FO和F1代啟動(dòng)子區(qū)域甲基化變化與F1代mRNA表達(dá)相一致的基因,利用MassARRAY以及QRT-PCR方法在C57小鼠和Aldh2-/-小鼠F0及F1代中,進(jìn)行擴(kuò)大樣本的DNA甲基化和mRNA水平驗(yàn)證。研究結(jié)果如下：一、3.3g/kg酒精處理的F0代KM小鼠體重顯著下降(p0.05),精子密度及精子活力呈減少趨勢(shì)；3.3g/kg酒精處理的C57和Aldh2-/-小鼠,其體重、睪丸和附睪重量均減少(p0.05),精子密度呈減少趨勢(shì)；隨著酒精處理劑量的增加,兩種小鼠睪丸內(nèi)精子凋亡率增加(p0.05)；與C57小鼠酒精處理組比較,Aldh2-/-小鼠對(duì)酒精敏感性更高,后者的死亡率高于前者；3.3g/kg酒精處理的Aldh2-/-小鼠,其睪酮激素、精子平均路徑速度(VAP)及平均曲線速度(VCL)均顯著減少(p0.05)。二、對(duì)于酒精處理的三種小鼠,其F1代存活率下降(p0.05),認(rèn)知、焦慮和抑郁程度均受到不同程度影響。酒精處理的KM小鼠F1代中出現(xiàn)了耳聾與急速轉(zhuǎn)圈兩種小鼠；與對(duì)照組比較,酒精處理組F1代KM小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降,焦慮抑郁情緒增加(p0.05)。酒精處理的F1代Aldh2-/-小鼠,其認(rèn)知及抑郁情緒受影響程度高于酒精處理的C57小鼠F1代。三、在KM小鼠印跡基因甲基化檢測(cè)中,我們觀察到F0代雄性小鼠的精子中,高劑量酒精處理后H19與Peg3基因DMR區(qū)甲基化改變顯著(p0.05)；在F1代小鼠大腦皮層中,Peg3基因的CpG7與CpG11兩個(gè)位點(diǎn)的甲基化變化與F0代精子中相同,有顯著性差異(P0.05)。 Snrpn基因在Fl代及F2代大腦皮層中觀察到甲基化顯著減少(p0.05)。其它印跡基因在F1代均未發(fā)現(xiàn)顯著的甲基化改變。4個(gè)印跡基因在F1代大腦皮層mRNA水平檢測(cè)顯示,酒精處理組Peg3基因mRNA表達(dá)有減少趨勢(shì),Snrpn基因有增加趨勢(shì),但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。四、利用酶切甲基化測(cè)序技術(shù)(MSCC)結(jié)合表達(dá)譜芯片對(duì)不同劑量酒精處理后C57 FO代精子及F1代海馬組織全基因組啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行甲基化檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)F0代甲基化改變且穩(wěn)定遺傳給F1代,且表達(dá)水平與甲基化程度相對(duì)應(yīng)的基因有12個(gè)。將這些基因在C57、Aldh2-/-小鼠F0及F1代中擴(kuò)大樣本進(jìn)行甲基化及mRNA水平驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Syt2基因的表達(dá)變化最有意義。進(jìn)一步機(jī)制研究及篩選實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。 綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)酒精長(zhǎng)期暴露能夠影響雄性小鼠生殖功能,引起精子某些基因甲基化發(fā)生改變,而這種異常的改變可傳遞到F1代,并導(dǎo)致相應(yīng)的基因的表達(dá)水平發(fā)生變化,這可能是F1代出現(xiàn)異常的部分原因。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R394

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本文編號(hào)：2724133