【摘要】：近年來,隨著抗生素的廣泛應(yīng)用,臨床病原細菌的耐藥性問題日益突出,己對人類健康構(gòu)成嚴重威脅。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)作為一種革蘭氏陰性機會致病菌,能夠在臨床中引發(fā)嚴重感染,是導致病人院內(nèi)感染的第三大致病菌。由于其內(nèi)在的高抗藥性及獲得性抗藥性,由銅綠假單胞菌引發(fā)的感染己越來越難以治愈。研究銅綠假單胞菌的致病性和耐藥機制,進而從新的角度防治銅綠假單胞菌引起的感染已變得極為重要。 銅綠假單胞菌的致病性受信號傳遞系統(tǒng)的調(diào)控。本研究涉及的與銅綠假單胞菌致病性相關(guān)的調(diào)控通路包括銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)、低于抑制濃度抗生素信號分子及自誘導信號分子AI-2(Autoinducer-2)。銅綠假單胞菌的致病因子受菌種特異的(Species-specific)高絲氨酸內(nèi)酯(Acyl-homoserine Lactone, AHL)介導的群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum Sensing Systems, QSS)和以喹諾酮(Quinolone)為信號分子的群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。銅綠假單胞菌擁有兩個基于AHL的系統(tǒng),一個是Las系統(tǒng),另一個是Rhl系統(tǒng),而基于喹諾酮的群體感應(yīng)系統(tǒng)的信號分子為PQS (Pseudomonas Quinolone Signal)和HHQ (2-heptyl-4-quinolone)�？股爻藗鹘y(tǒng)的殺菌或抑菌功能外,低于抑制濃度抗生素也可作為細菌間相互作用的信號分子,參與銅綠假單胞菌的基因調(diào)控。研究還表明,細菌通用(Universal)群體感應(yīng)系統(tǒng)的信號分子A1-2可以調(diào)控銅綠假單胞菌的致病性。這些信號傳遞系統(tǒng)不僅能夠調(diào)控銅綠假單胞菌的致病性,它們之間也存在著相互作用。細菌細胞間相互作用方面的研究不僅有利于了解病原菌的致病機理,而且也是以此為靶點開發(fā)新型藥物的重要基礎(chǔ)。 本課題重點研究信號傳遞系統(tǒng)對銅綠假單胞菌致病性的調(diào)控機制以及信號傳遞系統(tǒng)之間的相互作用,其主要工作包括以下四個部分： (1)在低于抑制濃度抗生素對銅綠假單胞菌致病因子調(diào)控的研究中,由于前期研究表明,銅綠假單胞菌吩嗪化合物受低于抑制濃度四環(huán)素的調(diào)節(jié)。本課題在此基礎(chǔ)上系統(tǒng)地研究了銅綠假單胞菌吩嗪合成受多種低于抑制濃度抗生素的調(diào)控作用。在基因組水平,利用飽和轉(zhuǎn)座突變方法,篩選并研究了對吩嗪合成操縱子PhzA1B1C1D1E1F1G1(phzA1)和phzA2B2C2D2E2F2G2(phzA2)有調(diào)節(jié)作用的基因及其調(diào)控途徑,尤其是與低于抑制濃度的壯觀霉素調(diào)節(jié)相關(guān)的基因及調(diào)控途徑。同時,以吩嗪合成操縱子為報道子,探索了群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)與低于抑制濃度抗生素調(diào)節(jié)系統(tǒng)之間的關(guān)系。 實驗發(fā)現(xiàn),低于抑制濃度的壯觀霉素(Spectinomycin, Spc)可以激活phzA1和phzA2操縱子的表達。在加入壯觀霉素的條件下,phzA1的表達比不加壯觀霉素時高出30倍,phzA2的表達則提高了4倍。在低于抑制濃度壯觀霉素的調(diào)節(jié)機理研究中,通過篩選約30,000個轉(zhuǎn)座突變體,在銅綠假單胞菌PAO1的全基因組中尋找到了參與壯觀霉素調(diào)節(jié)phzA1/phzA2表達的基因。其中l(wèi)asI、mvfR、vqsM、pqsE屬于正調(diào)節(jié)phzA1和phzA2表達的基因,與已知結(jié)果一致。實驗同時還篩選得到8個基因,這8個基因的突變不同程度地影響了壯觀霉素對phzA1/phzA2的調(diào)節(jié),表明這些基因可能參與這一調(diào)節(jié)過程。其中,基因ppk和基因pcnB被破壞之后,壯觀霉素對phzA1的表達比不加壯觀霉素時有明顯的升高,基因ppk編碼多磷酸激酶,而pcnB編碼poly(A)聚合酶。在以phzA2為報道子篩選的轉(zhuǎn)座突變體中,基因pilH、 pilY和pilX的突變使壯觀霉素對phzA2的激活增加,并且這些基因都與IV型菌毛合成蛋白有關(guān)�；騛lgC突變之后,壯觀霉素對phzA2的激活降低,該基因編碼磷酸甘露糖變位酶�；騮ruA和基因rsaL突變之后,壯觀霉素對phzA2的激活作用消失,即在該突變體中,加入壯觀霉素和不加的條件下,phzA2的表達沒有變化,truA是tRNA假尿嘧啶合成酶I的編碼基因,而rsaL編碼的產(chǎn)物是銅綠假單胞菌內(nèi)與QS系統(tǒng)有關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白。 (2)探究了銅綠假單胞菌群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)對致病因子吩嗪合成操縱子調(diào)控的機制�，F(xiàn)有研究表明,在銅綠假單胞菌PAO1的兩個操縱子phzA1B1C1D1E1F1G1(phzA1)和phzA2B2C2D2E2F2G2(phzA2)中,大部分吩嗪合成是由操縱子phzA1負責完成。為進一步了解phzA1和phzA2在PAO1中的分工和不同調(diào)節(jié)系統(tǒng)對這兩個操縱子作用的具體機制及其差別,本課題構(gòu)建和收集了多個調(diào)節(jié)系統(tǒng)突變體,并通過實驗在這些突變體中檢驗了兩個操縱子表達的變化。結(jié)果表明在lasl/rhll和pqsR缺失的突變體中,phzAl和phzA2的表達均受到了抑制。而在雙組分調(diào)控基因(Two-Component Regulatory System) gacA缺失的突變體中,phzA1的表達降低而phzA2的表達增強,從而表明gacA正調(diào)節(jié)phzA1而負調(diào)節(jié)phzA2。在△vqsR、ΔPA0011和ΔPA1243突變體中,phzA2受壯觀霉素的調(diào)節(jié)增強,而phzA1受壯觀霉素的調(diào)節(jié)作用不明顯。上述結(jié)果揭示phzA1和phzA2調(diào)節(jié)系統(tǒng)的差異可能與這些基因相關(guān)。另外,在針對調(diào)節(jié)子LasR、RhlR以及PqsR與phzA1相互作用的研究中,發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)蛋白LasR和RhlR并非直接結(jié)合在phzA1的啟動子區(qū)域上的。 (3)相關(guān)研究表明操縱子phzA1上游的啟動子區(qū)域含有一個las-box元件,是群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的調(diào)控應(yīng)答元件。而實驗室前期研究表明低于抑制濃度的四環(huán)素對phzA1的調(diào)控也依賴于這一元件,含有l(wèi)as-box啟動子的表達比不加las-box時的表達有所升高。因此,本課題證實了las-box與四環(huán)素的直接作用,las-box作為phzA1基因表達的活性位點,同時也是四環(huán)素直接調(diào)節(jié)phzA1表達的元件,本研究結(jié)果進一步證實了群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)與低于抑制濃度抗生素調(diào)節(jié)系統(tǒng)之間的關(guān)系。 (4)研究了信號分子AI.2對銅綠假單胞菌致病性的影響及其機理,結(jié)果表明加入外源的A1.2可對銅綠假單胞菌致病性產(chǎn)生重要影響。大鼠肺部感染動物模型實驗結(jié)果顯示,AI-2能夠加重銅綠假單胞菌肺部感染對肺組織的破壞。與銅綠假單胞菌單獨感染相比,AI-2的存在可使肺組織破壞程度加重。對AI-2作用機理的研究表明,AI-2能夠調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌中的Rhl系統(tǒng),對基因rhlI、rhlR和rhlAB的表達有激活作用,同時還發(fā)現(xiàn)AI.2能夠增加與Rh1系統(tǒng)相關(guān)的泳動能力。盡管A1-2能夠激活Rh1系統(tǒng)中的主要基因,實驗發(fā)現(xiàn),當存在AI-2時,Rh1群體感應(yīng)系統(tǒng)的信號分子C4-HSL對Rhl系統(tǒng)的激活作用降低。表明AI-2與Rhl系統(tǒng)中的信號分子C4-HSL具有競爭關(guān)系,從而使得AI-2存在的情況下,C4-HSL的活性降低。這些結(jié)果揭示AI.2對銅綠假單胞菌致病因子的調(diào)節(jié)很可能是通過Rhl群體感應(yīng)系統(tǒng)實現(xiàn)的。
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.991

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 吳虹;汪薇;韓雙艷;;鼠李糖脂生物表面活性劑的研究進展[J];微生物學通報;2007年01期

本文編號：2723982