【摘要】：在秀麗線蟲中,胰島素信號(hào)受體蛋白DAF-2的突變可以將線蟲的壽命延長(zhǎng)將近一倍,而此長(zhǎng)壽表型又完全依賴于叉頭轉(zhuǎn)錄因子FoxO在線蟲中的同源蛋白DAF-16的活性。這強(qiáng)烈暗示衰老是受到遺傳機(jī)制調(diào)控的。線蟲胰島素信號(hào)通路也因此成為了最近幾十年中衰老研究的主要對(duì)象之一。目前,針對(duì)線蟲胰島素信號(hào)通路開展的研究工作主要集中在單基因水平和轉(zhuǎn)錄組水平,對(duì)于胰島素信號(hào)對(duì)線蟲蛋白質(zhì)組的整體影響仍然所知甚少。僅有的一些研究線蟲胰島素信號(hào)通路突變體蛋白質(zhì)組的工作,定量數(shù)目較少,整體覆蓋率低,不利于系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)組水平的變化。 在本工作中,我建立并優(yōu)化了一整套適用于線蟲樣品的基于N-15穩(wěn)定同位素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)流程。首先,根據(jù)線蟲樣品的特點(diǎn),分別優(yōu)化了樣品制備方法、離線預(yù)分離方法以及色譜質(zhì)譜方法。其次,引入了更為可靠的定量軟件并完善了包括數(shù)據(jù)過(guò)濾以及統(tǒng)計(jì)分析在內(nèi)的數(shù)據(jù)后處理流程。該流程具有很好的技術(shù)可重復(fù)性和生物樣品可重復(fù)性,定量結(jié)果可靠性高且具有較高的蛋白質(zhì)組覆蓋度,提供了從線蟲樣品到最終定量結(jié)果的完整解決方案。我使用該流程對(duì)野生型線蟲和三種胰島素信號(hào)通路突變體線蟲(daf-2, daf-2;daf-16, daf-16)的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了定量研究與比較。在每個(gè)線蟲品系的一次生物重復(fù)中,平均可以對(duì)超過(guò)6000個(gè)蛋白進(jìn)行定量,大大超越了有記錄可查的線蟲蛋白組定量數(shù)量。本工作中的蛋白質(zhì)定量結(jié)果與之前類似工作中的定量結(jié)果具有高度的一致性。此外,daf-2突變體線蟲中的差異蛋白(與野生型相比)富集了已知的壽命調(diào)控基因,這一方面解釋了daf-2突變體線蟲為何具有長(zhǎng)壽表型；另一方面則暗示通過(guò)詳細(xì)研究在daf-2突變體線蟲中差異表達(dá)的蛋白質(zhì),更有可能發(fā)現(xiàn)新的壽命調(diào)控基因。 利用此定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù),我評(píng)價(jià)了DAF-16活性在重塑daf-2突變體線蟲蛋白質(zhì)組中的作用。分析表明,表達(dá)量在daf-2突變體線蟲和野生型線蟲之間存在差異的蛋白中,有且僅有約70%依賴于DAF-16的活性。與此相一致的是,在daf-2突變體線蟲中表達(dá)量顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)的編碼基因的promoter區(qū)并不富集已知的DAF-16結(jié)合元件,盡管其中依賴于DAF-16的那一部分上調(diào)蛋白質(zhì)的編碼基因的promoter區(qū)可以顯著富集DAF-16結(jié)合元件。有趣的是,表達(dá)量在daf-2突變體線蟲中顯著下調(diào)的基因,無(wú)論該下調(diào)是否依賴于DAF-16,其編碼基因的promoter區(qū)均無(wú)法富集到已知的DAF-16結(jié)合元件。這指出不依賴于DAF-16轉(zhuǎn)錄活性或間接依賴于DAF-16轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控機(jī)制對(duì)重塑daf-2突變體線蟲蛋白質(zhì)組起到了至關(guān)重要的作用。 通過(guò)比較蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù),我發(fā)現(xiàn)mRNA水平的變化和蛋白質(zhì)水平的變化在總體上的相關(guān)性僅為0.38(spearman相關(guān)系數(shù)),相當(dāng)一部分蛋白質(zhì)的表達(dá)量變化無(wú)法用其mRNA水平的變化來(lái)解釋。說(shuō)明轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制對(duì)重塑daf-2突變體線蟲蛋白質(zhì)組也起到了關(guān)鍵作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),相比于在mRNA和蛋白質(zhì)水平都下調(diào)的基因,僅在蛋白質(zhì)水平發(fā)生下調(diào)的基因擁有更長(zhǎng)、也更易于形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的3’UTR序列。這暗示包括microRNA在內(nèi)的一系列轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制可能參與了胰島素信號(hào)對(duì)蛋白質(zhì)組的重塑過(guò)程。 通過(guò)對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行深入的功能分析,我發(fā)現(xiàn)包括糖酵解、脂肪酸分解以及氨基酸分解在內(nèi)的三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解產(chǎn)能過(guò)程在daf-2突變體線蟲中得到了全面加強(qiáng),而包括mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯在內(nèi)的生物大分子合成過(guò)程在daf-2突變體線蟲中受到了廣泛的抑制。進(jìn)一步的生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明,干擾核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄后修飾過(guò)程可以進(jìn)一步延長(zhǎng)daf-2突變體線蟲的壽命,這很有可能是通過(guò)進(jìn)一步降低蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 網(wǎng)絡(luò)分析表明,表達(dá)量在daf-2突變體線蟲中發(fā)生變化的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中居于更加中心的位置,它們擁有更高的度和介數(shù),與網(wǎng)絡(luò)中其他蛋白的距離也更近。我進(jìn)一步將包含了差異蛋白的子網(wǎng)絡(luò)分解成了若干模塊,對(duì)主要模塊的功能進(jìn)行了分析,并找到了聯(lián)系不同模塊的重要的蛋白-蛋白相互作用,以期對(duì)最終闡明daf-2突變體線蟲差異蛋白質(zhì)組的內(nèi)部結(jié)構(gòu)做出貢獻(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3411
【圖文】：

于以下兩個(gè)原則[1^:首先，自然選擇的壓力隨著年齡的增長(zhǎng)不斷減弱；其次，生殖過(guò)程與體細(xì)胞的維持過(guò)程相互競(jìng)爭(zhēng)有限的能量和資源。（圖1-1)ORGANISMResources Growth Maintenance and RepairStorage ReproductionProgeny圖1-1在自然選擇的壓力之下，生物有機(jī)體根據(jù)環(huán)境條件在各耗能過(guò)程之間分配資源（引自 Thomas Kirkwood, 2005)3

秀麗線蟲是衰老的遺傳分析中不可多得的優(yōu)秀模式生物，對(duì)衰老的機(jī)理研究做出了不可磨滅的貢獻(xiàn)。線蟲培養(yǎng)成本低，生命周期短，很多關(guān)鍵基因、信號(hào)通路以及生理過(guò)程都在哺乳動(dòng)物中保守。事實(shí)上，早在作為衰老研究的模式生物之前，線蟲就已經(jīng)成為了遺傳學(xué)及分子生物學(xué)中常用的模式生物。最早將線蟲引入生物學(xué)研究領(lǐng)域的是B「enne「和Sulston[i4' 15]，他們的工作奠定了線蟲的模式生物地位。線蟲的成蟲長(zhǎng)1 mm左右，2CrC培養(yǎng)時(shí)生殖期有3.5天。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)線蟲可以用固體或者液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度在15°C到25r之間，可以比較容易的擴(kuò)增培養(yǎng)到較大的群體。長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)可以將線蟲用液氮凍起來(lái)，化開后仍能存活。5

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 蔡鈾慶;;一種雙鏈RNA依賴的蛋白激酶突變體引發(fā)惡性轉(zhuǎn)化[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;1993年04期

2 任紅;乙型肝炎表面抗原“免疫逃避”突變體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)[J];中華肝臟病雜志;1994年03期

3 盧瑩,陳光椿,李憶東,盧建;前列腺癌中發(fā)現(xiàn)的4種雄激素受體突變體在PC3細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄激活功能的研究[J];中國(guó)病理生理雜志;2003年11期

4 汪海鵬;張雪蓮;曹健;;結(jié)核分枝桿菌活性減毒突變體——新型抗結(jié)核分枝桿菌候選疫苗[J];中國(guó)感染控制雜志;2006年04期

5 朱艷紅;韓慶霞;任偉;牛安歐;李柳哲;;日本血吸蟲Sj23DNA突變體疫苗的構(gòu)建與鑒定[J];中國(guó)血吸蟲病防治雜志;2006年05期

6 廖維維;葉t錦;;GATA轉(zhuǎn)錄因子和血液系統(tǒng)疾病[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2007年04期

7 姜凡;伍志強(qiáng);趙亞力;楊潔;尹肖云;韓為東;;Id蛋白N末端突變體真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其三維空間模型預(yù)測(cè)[J];軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào);2008年06期

8 張亞妮;楊亮;段康民;;銅綠假單胞菌gshb基因突變對(duì)MexXY-OprM主動(dòng)外排泵表達(dá)的影響[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年23期

9 鄒明學(xué);陳艷紅;;擬南芥突變體tgd表型和分子生物學(xué)特性分析(英文)[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2009年06期

10 張金玲;馬南佳;汪軍遠(yuǎn);方井晉;劉曉妮;;聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體的純化與分析[J];華西藥學(xué)雜志;2010年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 周紅;王國(guó)力;黃培堂;黃翠芬;;組織型纖溶酶原激活劑新型突變體的分子設(shè)計(jì)及其生物活性的初步分析[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展（上冊(cè)）[C];1999年

2 劉婧;張方;王寶山;陳凡;謝先芝;;水稻光敏色素B缺陷型突變體具有較強(qiáng)的干旱脅迫耐性[A];植物分子生物學(xué)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)——全國(guó)植物生物學(xué)研討會(huì)論文摘要集[C];2010年

3 孫璐;文欣;譚英;李賀陽(yáng);趙月芳;牛聰偉;席真;;原卟啉原氧化酶及其突變體的酶學(xué)性質(zhì)研究[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第26屆學(xué)術(shù)年會(huì)化學(xué)生物分會(huì)場(chǎng)論文集[C];2008年

4 萬(wàn)崎;章晚聯(lián);陳新文;;丙型肝炎病毒E2糖蛋白糖基化突變體的研究[A];中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)首屆學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2003年

5 周靜;張國(guó)珍;彭友良;;稻瘟病菌一個(gè)菌落生長(zhǎng)緩慢突變體的研究[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2004年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2004年

6 金衛(wèi);;水稻長(zhǎng)護(hù)穎突變體初步研究[A];全國(guó)作物生物技術(shù)與誘變技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

7 朱傳鳳;吳家和;何朝族;;一個(gè)水稻半矮稈突變體的鑒定及其分子功能研究[A];全國(guó)植物分子育種研討會(huì)摘要集[C];2009年

8 張舒亞;周明國(guó);李紅霞;;稻梨孢抗嘧菌酯突變體B9-R2的生物學(xué)性狀研究[A];2003’華東植物病理學(xué)術(shù)研討會(huì)暨江蘇省植物病理學(xué)會(huì)第十次會(huì)員代表大會(huì)論文集[C];2003年

9 王才林;趙凌;周壽芳;;廣親和eui水稻矮稈遲熟突變體“02428ha”的遺傳分析[A];中國(guó)的遺傳學(xué)研究——中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)第七次代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編[C];2003年

10 戴新賓;張榮銑;許長(zhǎng)成;匡廷云;;水稻葉綠素b減少突變體的光抑制特性研究[A];全國(guó)植物光合作用、光生物學(xué)及其相關(guān)的分子生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2001年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 李天舒;玉米中可提取抗艾物質(zhì)[N];健康報(bào);2010年

2 記者　 龍軍;雜交稻種子鑒定找到新方法[N];光明日?qǐng)?bào);2006年

3 記者 朱興忠;甘州重離子束選育玉米新品種獲突破[N];張掖日?qǐng)?bào);2008年

4 江南雪舞;病毒“善變”[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2005年

5 胡必強(qiáng)邋記者 趙鳳華;我科學(xué)家發(fā)現(xiàn)水稻黃綠葉突變基因[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

6 申淳;我國(guó)發(fā)現(xiàn)水稻黃綠葉突變基因[N];中國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)報(bào);2007年

7 近物所;甘肅重離子輻照玉米誘變育種有新突破[N];農(nóng)資導(dǎo)報(bào);2008年

8 安芬奇;我國(guó)育成膏桐新品種[N];中國(guó)綠色時(shí)報(bào);2008年

9 劉舒 李安安;張啟發(fā)團(tuán)隊(duì)克隆出新基因[N];江蘇科技報(bào);2008年

10 科綜;水稻“長(zhǎng)生不老”可被制約[N];大眾科技報(bào);2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 向建華;擬南芥UNC-93基因的功能研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

2 蒲志剛;水稻航天誘變突變體變異分析及應(yīng)用研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 閆加慶;過(guò)表達(dá)人源E46K突變體α-synuclein對(duì)蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

4 張樹梅;NP突變體抑制流感病毒復(fù)制的機(jī)制及形成流感病毒病毒樣顆粒的關(guān)鍵蛋白[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

5 張攀;秀麗線蟲胰島素信號(hào)通路突變體的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

6 趙淑娟;突變體黑羽鵪鶉的純化及其MHC class Ⅰ基因多態(tài)性與免疫功能關(guān)系研究[D];吉林大學(xué);2011年

7 田義新;擬南芥糖感知信號(hào)突變體mig3的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

8 蒲媛媛;甘藍(lán)型油菜顯性光葉突變體BnaA.GL基因定位和表皮蠟質(zhì)分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

9 藺潔;枯草溶菌素轉(zhuǎn)換酶9基因新突變的發(fā)現(xiàn)及其功能初步研究[D];南華大學(xué);2011年

10 田風(fēng)霞;小麥滯綠突變體tasg1抗旱生理特性及分子機(jī)制研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 陳再冉;虎紋捕鳥蛛毒素-Ⅳ突變體K27A的化學(xué)合成與性質(zhì)以及兩種海南敬釗纓毛蛛毒素的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];湖南師范大學(xué);2003年

2 王飛;甘薯類胡蘿卜素合成相關(guān)基因片段的克隆[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

3 孫嗣梅;蓖麻毒素A鏈及其突變體的表達(dá)、純化和分析[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

4 劉君紹;茄子抗黃萎病（Verticillium wilt）突變體的離體篩選[D];西南農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

5 楊芳;水稻向地性突變體的生理研究、遺傳分析及相關(guān)基因的分子標(biāo)記定位[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

6 丁業(yè)掌;陸地棉兩個(gè)纖維突變體的遺傳以及纖維和短絨基因SSR標(biāo)記分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

7 宋景嬌;鹽沼鹽桿菌bop基因及啟動(dòng)子的克隆及BR蛋白突變體的構(gòu)建和光致變色功能的研究[D];武漢大學(xué);2005年

8 霍華蕾;從山羊草中分離小麥籽粒硬度主效基因突變體的研究[D];華中科技大學(xué);2005年

9 齊興云;鹽芥ThTRXh蛋白的亞細(xì)胞定位及AtTRXh突變體的表型分析[D];山東師范大學(xué);2006年

10 殷亮;低分子量尿激酶與ATF-Fc融合蛋白的研究[D];吉林大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2722339