【摘要】： 人層粘連蛋白α4鏈于1994年發(fā)現(xiàn)，其染色體定位于6q21，有39個(gè)外顯子，長(zhǎng)122kbp。其開放閱讀框架為5448bp，編碼1581個(gè)氨基酸，主要分布在來源于中胚層的組織，如內(nèi)皮基底膜、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞，也在上皮基底膜處存在，如表皮、唾液腺、胰臟、食管、腸陷窩、腎皮質(zhì)小管、胃腺。α4鏈?zhǔn)莑aminin-8(α4β1γ1)和laminin-9(α4β2γ1)的亞基之一，在骨骼肌毛細(xì)血管，α4鏈在E11期出現(xiàn)，持續(xù)到成年期，α4鏈的生物學(xué)功能迄今仍不太清楚，在人類的疾病和異常反應(yīng)中沒有發(fā)現(xiàn)和α4鏈有關(guān)，但是α4鏈在發(fā)育中的微血管處廣泛和特異性表達(dá)提示α4鏈可能參與了血管生成作用。α4鏈基因敲除小鼠的皮下組織和肌肉廣泛性出血，從而導(dǎo)致貧血、微血管廣泛性出血、運(yùn)動(dòng)缺陷，電鏡下觀察到微血管結(jié)構(gòu)受到破壞，毛細(xì)血管的基板不連續(xù)，這些事實(shí)說明α4鏈在新生毛細(xì)血管基底膜的形成和結(jié)構(gòu)的完整性方面有非常重要的作用。在腦部腫瘤如多形性成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、腦膜瘤α4鏈過表達(dá)，這可能成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷指標(biāo)之一。 研究表明層粘連蛋白的G結(jié)構(gòu)域和諸如整和素、等細(xì)胞受體及其它的細(xì)胞外配體間的相互作用對(duì)于基底膜的完整性非常重要；可以介導(dǎo)整和素依賴性的細(xì)胞粘附，在腦部腫瘤如多形性成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、腦膜瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲中有重要作用。為了研究LG1-3組件的晶體結(jié)構(gòu)、LG1-3結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了如下工作： 層粘連蛋白α4鏈LG2組件基因的原核表達(dá)通過RT-PCR擴(kuò)增了576bp的LG2組件的cDNA，將其重組到克隆載體和原核表達(dá)載體，構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pMD-LG2和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-LG2，以BL21(DE3)為宿主菌，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)了重組的26kDa LG2蛋白，利用SDS-PAGE的方法初步純化了重組的LG2蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶，為L(zhǎng)G2-3單克隆抗體的篩選提供了抗原。 層粘連蛋白α4鏈LG2-3組件單克隆抗體的制備為滿足檢測(cè)重組LG1-3之需要，通過RT-PCR擴(kuò)增了層粘連蛋白α4鏈1266bp的LG2-3組件cDNA，構(gòu)建了LG2-3組件的克隆質(zhì)粒pMD-LG2-3和真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-LG2-3。通過基因免疫的方式用真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-LG2-3免疫BALB／c小鼠，通過常規(guī)的細(xì)胞融合，間接ELISA篩選和有限稀釋克隆，建立了1株雜交瘤細(xì)胞株CF12，CF12單克隆抗體對(duì)重組表達(dá)的LG2有特異性反應(yīng)，隨后進(jìn)行了使用CF12單克隆抗體對(duì)胎兒腎臟、小腸、大動(dòng)脈進(jìn)行的免疫組化研究結(jié)果表明，在腎小管的基底膜、腎小球囊細(xì)胞膜、小腸漿膜、平滑肌及毛細(xì)血管內(nèi)皮、小腸絨毛上皮細(xì)胞、大動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞膜均出現(xiàn)陽性反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道一致，從而證明了通過基因免疫制備的單克隆抗體的特異性。 層粘連蛋白α4鏈LG1-3組件基因在Pichia pastrois中的表達(dá)通過RT-PCR擴(kuò)增了α4鏈1800bp的LG1-3組件cDNA，構(gòu)建了其克隆質(zhì)粒pMD-LG1-3。通過體外定點(diǎn)突變， 經(jīng)過三次 PCR將位于 LGI－3組件 960hp處的 SaCI酶切位點(diǎn) GAGCTC突變?yōu)?GAGCGC， 構(gòu)建了SQC酶切位點(diǎn)突變的LG司組件基因的克隆質(zhì)粒pMD－MLG13和酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPICZ－MLG13，pPICZ－MLG13經(jīng) Sacl線性化后通過電轉(zhuǎn)化將 LGI－3組件基因整和到畢 赤酵母GSlls細(xì)胞染色體上，利用PCR和表型篩選篩選到7株整和LGI．3組件基因的畢 赤酵母GSlls細(xì)胞，在甲醇誘導(dǎo)下，經(jīng)SDS．PAGE和Westffo blot檢測(cè)到了LGI－3組件 基因的表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)獲得的人層粘連蛋白 a 4鏈 LGZ－3單克隆抗體和 LGI－3重組蛋白為進(jìn)一步深入 研究LGI．3的結(jié)構(gòu)和功能間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍需大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R346
【圖文】：

介導(dǎo)的細(xì)胞粘附，其中的兩個(gè)膚(AG一10、AG一32)片層，二者在重組的QILGI一5中時(shí)均不和Q6p蛋白受體是。一dystrogiycan，后者借助跨膜蛋白glycan和層粘連蛋白的E3片段、laminin.2、基底99)19]。。一dy‘troglycan和laminin一l的E3片段的，。一勿stroglycan結(jié)合于層粘連蛋白的位點(diǎn)和同位置，但利用位于G爪、脹、N“N片層的其，而且既然這種結(jié)合是鈣依賴性的，所以。ILG4ohenester等1999)[71。aZLe一3、aZLo4一5和烈的多，單獨(dú)的LG組件不相結(jié)合，僅QZLG3過點(diǎn)突變確定了。ZLGS參與和。一dystroglycanari眺ulfatied結(jié)合沒有明顯的相關(guān)性(Hohenester結(jié)合aILG4·5，而不是aZLol一3及aZLGI一3，[61的只有。2鏈LG組件的串聯(lián)形式才能和a

由二硫鍵來穩(wěn)定。5、IH、V結(jié)構(gòu)域在laminin一1短臂上的m、V區(qū)域由一系列3一8個(gè)EGF樣LE組件組成(如圖5)，電鏡下W、W、VI球狀結(jié)構(gòu)域被桿狀的結(jié)構(gòu)域隔開。層粘連蛋白的LE組件和典型的EGF8

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8 朱耀e

本文編號(hào)：2722166