【摘要】：間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)因其具有多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)功能,已被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)、自身免疫性疾病的臨床研究之中。和造血干細(xì)胞等其他干細(xì)胞不同,MSCs是一類(lèi)在體外易于擴(kuò)增的干細(xì)胞。因此,雖然MSCs在體內(nèi)含量極少,但可以通過(guò)體外擴(kuò)增制備大量的MSCs,以滿(mǎn)足臨床使用的需要。雖然許多研究結(jié)果顯示,體外擴(kuò)增的MSCs用于臨床試驗(yàn)時(shí)未見(jiàn)明顯的毒副作用,但是我們目前對(duì)MSCs的生物學(xué)特性了解還不是十分清楚,制備供臨床使用的MSCs的體外操作過(guò)程是否會(huì)對(duì)MSCs產(chǎn)生不利的影響也還未有定論。目前還不能說(shuō)MSCs就是一種安全的細(xì)胞治療產(chǎn)品,許多MSCs臨床應(yīng)用相關(guān)的安全性問(wèn)題還值得我們?nèi)ヌ剿�。�?duì)于體外擴(kuò)增是否會(huì)影響MSCs的生物學(xué)特性,是否會(huì)影響其臨床使用的安全性等問(wèn)題,還缺少系統(tǒng)而全面的研究。 本研究以人臍帶MSCs (human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells, hUC-MSCs)為研究對(duì)象,研究體外長(zhǎng)期傳代對(duì)hUC-MSCs生物學(xué)特性,包括分化潛能、致瘤性、基因組穩(wěn)定性等的影響,并在食蟹猴中對(duì)體外傳代的hUC-MSCs進(jìn)行了體內(nèi)的長(zhǎng)期毒性分析,為評(píng)價(jià)體外擴(kuò)增的hUC-MSCs作為臨床使用的安全性提供必要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。文章將分為三個(gè)部分： 第一部分,體外長(zhǎng)期傳代對(duì)hUC-MSCs生物學(xué)特性的影響 我們對(duì)多個(gè)不同個(gè)體來(lái)源的hUC-MSCs在體外進(jìn)行了長(zhǎng)期傳代培養(yǎng),所有樣本均未在體外培養(yǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出無(wú)限的增殖能力,也未發(fā)現(xiàn)任何惡性轉(zhuǎn)化的跡象。體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的hUC-MSCs陸續(xù)停止了分裂增殖,并出現(xiàn)衰老的特征。在體外進(jìn)行了30個(gè)代次的傳代培養(yǎng)之后,hUC-MSCs仍然保持了其基本的細(xì)胞表面分子標(biāo)記和多向分化潛能。在本研究所涉及的低代次的hUC-MSCs中,都能檢測(cè)到hTERT的表達(dá),其表達(dá)水平在體外培養(yǎng)過(guò)程中未有升高,而是逐漸降低,甚至消失。不論其是否在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中一直存在hTERT的表達(dá),hUC-MSCs的平均端粒長(zhǎng)度在體外傳代過(guò)程中不斷縮短。hUC-MSCs中較低的hTERT表達(dá),不足以維持其在分裂增殖過(guò)程中的端粒長(zhǎng)度。 在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)過(guò)程中,hUC-MSCs出現(xiàn)染色體數(shù)目突變的可能性存在,但是較小。然而,體外培養(yǎng)的hUC-MSCs普遍會(huì)出現(xiàn)拷貝數(shù)的變異(Copy Number Variation, CNV)。不同個(gè)體來(lái)源的hUC-MSCs出現(xiàn)CNV的頻率相差較大。 通過(guò)對(duì)高低代次hUC-MSCs轉(zhuǎn)錄組的研究分析,我們發(fā)現(xiàn),基因組穩(wěn)定的hUC-MSCs和基因組不穩(wěn)定的hUC-MSCs在轉(zhuǎn)錄組水平存在著較大的差異。一些與DNA損傷反應(yīng)、錯(cuò)配修復(fù)、染色體穩(wěn)定性維持的相關(guān)信號(hào)通路,在基因組穩(wěn)定的hUC-MSCs和基因組不穩(wěn)定的hUC-MSCs勺體外長(zhǎng)期傳代過(guò)程中,表現(xiàn)出完全相反的變化趨勢(shì)。 我們的研究結(jié)果為定期檢測(cè)體外培養(yǎng)的MSCs的基因組穩(wěn)定性及其相關(guān)基因的表達(dá)水平提供了必要的理論依據(jù),也為篩選基因組的穩(wěn)定的hUC-MSCs進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)提供了新的方法。 第二部分,hUC-MSCs在無(wú)血清培養(yǎng)基中的長(zhǎng)期傳代培養(yǎng) 雖然從安全性和質(zhì)量、過(guò)程的可控性等方面講,無(wú)血清培養(yǎng)體系是制備供臨床使用的hUC-MSCs的最理想的培養(yǎng)方案。但是,之前的研究往往集中于如何在無(wú)血清培養(yǎng)基中提高M(jìn)SCs的貼壁和增殖能力,而對(duì)其基因組穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄組變化情況等臨床使用安全性相關(guān)的問(wèn)題研究得還比較有限。因此,我們建立了無(wú)血清、無(wú)動(dòng)物源成分、無(wú)人源成分、化學(xué)成分完全清晰的hUC-MSCs培養(yǎng)體系,并對(duì)在該體系中長(zhǎng)期培養(yǎng)的hUC-MSCs進(jìn)行細(xì)胞表面分子標(biāo)記、hTERT的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄組和基因組穩(wěn)定性等生物學(xué)特性的分析,并和傳統(tǒng)有血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hUC-MSCs進(jìn)行了比較。 我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在無(wú)血清培養(yǎng)基中,hUC-MSCs分裂增殖得更慢,在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)后逐漸出現(xiàn)了衰老的特征并停止生長(zhǎng),其hTERT表達(dá)也迅速消失。但是無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hUC-MSCs的細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況仍然保持了和傳統(tǒng)有血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hUC-MSCs基本一致,也具有分化成脂肪、骨、軟骨的多向分化潛能。與有血清培養(yǎng)基中的情況一樣,無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hUC-MSCs也會(huì)發(fā)生CNV的變異。無(wú)血清和有血清中培養(yǎng)的hUC-MSCs最大的差異是轉(zhuǎn)錄組的不同。許多和細(xì)胞周期和增殖相關(guān)的基因在無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)源的hUC-MSCs中有較大的變化。在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hUC-MSCs中,未發(fā)現(xiàn)原癌基因表達(dá)水平異常升高等惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的跡象。 第三部分,hUC-MSCs反復(fù)靜脈滴注給予食蟹猴6周的毒性試驗(yàn) 為了觀察hUC-MSCs反復(fù)靜脈滴注給予食蟹猴的毒性反應(yīng)以及hUC-MSCs在其體內(nèi)的定植分化情況,為其臨床研究提供動(dòng)物試驗(yàn)資料,我們?cè)谑承泛矬w內(nèi)對(duì)hUC-MSCs進(jìn)行了反復(fù)靜脈滴注的毒性實(shí)驗(yàn)。 試驗(yàn)選用32只食蟹猴,雌雄各半。后肢靜脈滴注給藥,每2周給藥1次,連續(xù)給藥4次,共6周。試驗(yàn)期間進(jìn)行了臨床觀察、體重、體溫、心電圖、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、凝血功能、血液生化、尿液、眼科、T淋巴細(xì)胞亞群(CD3、CD4和CD8)、淋巴細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-4)、抗體、骨髓涂片等指標(biāo)的檢查。動(dòng)物安樂(lè)死后進(jìn)行大體解剖、主要臟器稱(chēng)重,并對(duì)40多種組織器官進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。同時(shí)進(jìn)行了毒代動(dòng)力學(xué),以及hUC-MSCs在動(dòng)物體內(nèi)的定植和分布的研究。 結(jié)果顯示,試驗(yàn)期間各給藥組動(dòng)物的體重、體溫、心電圖指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、骨髓涂片、尿常規(guī)、眼科檢查、臟器重量均未見(jiàn)有毒理學(xué)意義的規(guī)律性改變�？赡艿亩拘苑磻�(yīng)為嘔吐,RBC、HGB和HCT降低,APTT延長(zhǎng),hUC-MSCsP13高劑量組1只動(dòng)物肺組織見(jiàn)陳舊性肺出血和間質(zhì)性肺炎以及肝臟小膽管周?chē)椎谋憩F(xiàn),不確定與藥物相關(guān)性。hUC-MSCs反復(fù)靜脈滴注,對(duì)注射部位的血管無(wú)明顯的刺激性損傷作用。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中,未見(jiàn)明顯的排異反應(yīng),未見(jiàn)明顯的腫瘤發(fā)生；個(gè)別動(dòng)物中檢測(cè)到免疫學(xué)細(xì)胞因子認(rèn)為沒(méi)有重要的毒理學(xué)意義；不同代次的hUC-MSCs與其可能的毒性反應(yīng)無(wú)明顯相關(guān)性。hUC-MSCs反復(fù)靜脈滴注給予食蟹猴,免疫原性較弱,未檢查出針對(duì)完整細(xì)胞的抗體形成。 末次藥后次日, hUC-MSCs P7低劑量組1只動(dòng)物的心臟、腦,hUC-MSCs P7高劑量組1只動(dòng)物的肝臟,hUC-MSCs P13高劑量組1只動(dòng)物心臟,1只動(dòng)物的肺、股四頭肌、骨髓均可檢測(cè)到hUC-MSCs,但免疫組化未檢出US-MSC在這些組織中定植分化。停藥2周及6周后,各組動(dòng)物各組織中均未檢測(cè)到hUC-MSCs分布。 綜上所述,在本試驗(yàn)條件下,hUC-MSCs反復(fù)靜脈滴注給予食蟹猴的安全劑量為1.0×107細(xì)胞/公斤,該劑量是臨床擬用劑量的10-20倍。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳紹良,方五旺,錢(qián)鈞,葉飛,劉煜昊,單守杰,張俊杰,林松,廖聯(lián)明,趙春華;Improvement of cardiac function after transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in patients with acute myocardial infarction[J];Chinese Medical Journal;2004年10期

本文編號(hào)：2721002