發(fā)布時(shí)間：2020-06-19 11:39

【摘要】： 4-1BB配體(4-1BB ligand，4-1BBL)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，主要表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞(APC)，包括CD40活化的B細(xì)胞，γ-IFN活化的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，還可在B細(xì)胞性惡性腫瘤細(xì)胞株及單核細(xì)胞上表達(dá)。其相應(yīng)受體4-1BB則誘導(dǎo)表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞表面，4-1BB／4-1BBL的相互作用在促發(fā)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答，特別是在機(jī)體的抗腫瘤免疫、移植免疫和自身免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。近年來(lái)，4-1BBL分子在腫瘤免疫治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值正倍受關(guān)注。但迄今為止，國(guó)內(nèi)尚無(wú)商品化的4-1BBL重組產(chǎn)品。鑒此，我們?cè)趪?guó)內(nèi)率先采用基因工程技術(shù)克隆了編碼人4-1BBL胞外段的cDNA，并在畢氏酵母GS115中進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)對(duì)獲得的重組人可溶性4-1BBL蛋白潛在的生物學(xué)功能進(jìn)行了系列探討。 4-1BBL由255個(gè)氨基酸組成，是Ⅱ型跨膜糖蛋白，有膜結(jié)合型和可溶性兩種形式。膜型分子可被蛋白酶裂解以可溶性形式(soluble 4-1BB ligand，s4-1BBL)存在，而185個(gè)氨基酸組成的胞外段則構(gòu)成了s4-1BBL。 s4-1BBL作為一種新型共刺激分子在T細(xì)胞的活化、增殖、存活和對(duì)樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增及在腫瘤生物治療方面的作用和價(jià)值則是本研究的重點(diǎn)；此外，成功構(gòu)建了人4-1BB分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，并通過此細(xì)胞對(duì)4-1BBL分子介導(dǎo)的反向信號(hào)傳導(dǎo)亦做了初步的探討，以期為4-1BBL和4-1BB分子在自身免疫和移植免疫中的作用提供理論依據(jù)。 一．重組人可溶性4-1BB配體(rhs4-1BBL)在畢氏酵母中的高效表達(dá)及鑒定 采用RT-PCR，PCR方法從CD40單抗活化的人扁桃體淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增出4-1BBL全長(zhǎng)和胞外段基因，后者即為可溶性4-1BBL cDNA，并將之克隆入PUCTm載體；此cDNA序列經(jīng)測(cè)序證實(shí)正確后再導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA的α信號(hào)肽序列中，構(gòu)建成重組 人可溶性4一IBB配體在畢氏醉母中的表彝及其生物學(xué)功能的研究 中文摘要 分泌型表達(dá)載體PPIc及認(rèn)ees4一IBBL;Sacl限布雌內(nèi)切酶酶切使之線性化，再電轉(zhuǎn)化 法將線性化的pPIcZaAees4一IBBL質(zhì)粒導(dǎo)入畢氏酵母菌株GSll5，并以同源重組形式整 合到酵母染色體的A0x位點(diǎn)，經(jīng)ze。。i�？剐园邕x陽(yáng)性克隆。同時(shí)，挑取陽(yáng)性克隆在 含甲醇的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，并分別于培養(yǎng)的第24h，48h，矜h分別吸出酵母上清， 離心后進(jìn)行1挑DS一PAGE電泳和western Blotting分析鑒成s4一IBBL的表達(dá)情況， 得到能在甲醇誘導(dǎo)下穩(wěn)定分泌rhs4一IBBL的基因工程菌GSllswepPIczaA一s4一IBBL。應(yīng) 用全自動(dòng)發(fā)酵裝置進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)陰離子交換層析方法分離、純化，獲得純度達(dá)9鞏以 上，分子蛋約21Kda的rhs4一IBBL重組蛋白，紫外分光光度儀定量其最高表達(dá)量達(dá) 25 pg/ml。 二.重組人可溶性4一IBB配體(rhs4一IBBL)的生物學(xué)功能探討 1 .rhs4一IBBL刺激T細(xì)胞特性的研究 T細(xì)胞的活化需要雙重信號(hào)，即除A『川C復(fù)合物提供的特異性抗原刺激信號(hào) 外，還需要非抗原特異的和非陽(yáng)C限制的共刺激信號(hào)，T細(xì)胞只有獲得這二個(gè)信號(hào)后， 才能發(fā)生有效的活化、增殖，進(jìn)而發(fā)揮其效應(yīng)功能，如分泌細(xì)胞因子或細(xì)胞毒性T 細(xì)胞(口L)的溶細(xì)胞效應(yīng)。若無(wú)第一信號(hào)，可導(dǎo)致T細(xì)胞失活和死亡。同樣若缺乏 共刺激信號(hào)，T細(xì)胞將進(jìn)入無(wú)反應(yīng)狀態(tài)，甚至發(fā)生凋亡�；罨疶淋巴細(xì)胞在宿主防御 病毒感染、抗腫瘤和移植排斥中發(fā)揮重要作用，并參與自身免疫病的發(fā)展過程。因 此，4一IBB/4一IBBL協(xié)同刺激信號(hào)對(duì)T細(xì)胞的激發(fā)和功能介導(dǎo)起著極其重要的調(diào)節(jié)作 用。 本研究結(jié)果顯示: (1)純化T細(xì)胞經(jīng)cD3激發(fā)型單護(hù)喇激后12h，細(xì)胞呈現(xiàn)活化狀態(tài)，顯微鏡下觀察 細(xì)胞增大增多，逐漸成團(tuán)生長(zhǎng)，T細(xì)胞表面4-- IBB分子開始表達(dá)，約48h達(dá)活化高峰， 4一IBB分子表達(dá)陽(yáng)性率達(dá)6既，并能維持4幣d。 (2)rha4一IBBL對(duì)T細(xì)胞存活和增殖的影響:cD3單抗激發(fā)的T細(xì)胞在一周內(nèi)逐漸凋 亡，加入 rhs4一1 BBL重組蛋白、cD28單抗(CD28InAb)或外源性IL--2后T細(xì)胞存活 均明顯延長(zhǎng)(P0 .05)，雖然二種共刺激分子對(duì)T細(xì)胞作用相仿(P0 .05)，但和I卜2 均具有協(xié)同效應(yīng)，而且其聯(lián)合后和I卜2共同作用更明顯(P0 .05)，最長(zhǎng)可使T細(xì)胞 存活6--7周。另外，3[Hl一dR結(jié)果也顯示，rhs4一1 BBL和CD28InAb可以協(xié)同刺激活 人可溶性今IBB配體在畢氏醉母中的表達(dá)及其生物學(xué)功能的研究 中文摘要 化T細(xì)胞體外增殖。以上結(jié)果均證實(shí)4一IBBL信號(hào)獨(dú)立于CD28信號(hào)之外，并與CD28 分子一樣為T細(xì)胞的活化、增殖和進(jìn)一步延長(zhǎng)其存活提供了強(qiáng)有力的第二信號(hào)。 (3)rhs4一IBBL和CD28InAb可以使活化T細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素2(I卜2)。1 L--2為淋巴 細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在體外可以促進(jìn)T細(xì)胞存活。rhs4一IBBL加CD28InAb聯(lián)合促進(jìn)T細(xì)胞 分泌IL--2效應(yīng)明顯強(qiáng)于兩者單獨(dú)使用(P0 .05)。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞培養(yǎng)第2 天分泌的I卜2高于第5天(P0 .05)，此現(xiàn)象說(shuō)明IL一2的分泌具有時(shí)效性，隨時(shí)間 的延長(zhǎng)其含t下降是因?yàn)門細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中消耗了I卜2。這也進(jìn)一步說(shuō)明T細(xì)胞 自分泌I卜2是影響T細(xì)胞擴(kuò)增的主要因子。 (4)rhs4一IBBL和CD28mAb對(duì)T細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響:凋亡率檢測(cè)結(jié)果顯示， CD3單抗活化72一96h的T細(xì)胞平均凋亡率為37.5士3.5%，大部分細(xì)胞已開始進(jìn)入凋 亡期
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R392.1
【圖文】：

圖5:重組表達(dá)質(zhì)粒勿HCZQA一s今Il:pCR產(chǎn)物2，3:ppICZa^空質(zhì)粒45:重組質(zhì)粒ppICZQA一54一IBBLXhoFig·5:AnalysisofrceombinantPlasmNote:l:PCRProduetZ，3:PPICZQA5:PPICZQA一54一IBBLdigestedwit27

4一IBBLPCR產(chǎn)物的凝膠電泳(胞外段基因)

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2 許y斏

本文編號(hào)：2720737