【摘要】：登革病毒是黃病毒科的重要成員，包括四個(gè)血清型，其每個(gè)血清型均可使人發(fā)病，癥狀從較輕微的DF，到較為嚴(yán)重的DHF／DSS。近年來，隨著全球氣候變暖和國際交往的日益頻繁，DF和DHF／DSS的發(fā)病率迅速上升。目前，DF／DHF已成為熱帶和亞熱帶地區(qū)最為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。 到目前為止，仍沒有安全有效的登革疫苗用于臨床。傳統(tǒng)的減毒活疫苗已進(jìn)行多年的臨床試驗(yàn)，人們也一度認(rèn)為該疫苗是最有希望進(jìn)入臨床使用的疫苗，但最近大量的臨床數(shù)據(jù)表明，四價(jià)減毒活疫苗不足以同時(shí)提供針對(duì)四個(gè)血清型的保護(hù)性應(yīng)答反應(yīng)。因此，登革新型疫苗的研究極為迫切和重要。 DNA疫苗是90年代出現(xiàn)的一種新的疫苗形式。該疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，可同時(shí)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答、并具有制備簡單、無毒力回復(fù)、可聯(lián)合接種等優(yōu)勢(shì)。目前該技術(shù)已用于構(gòu)建JEV、HIV、流感、乙型肝炎和HSV等的疫苗侯選株。將含有登革病毒prM、E或NS1等抗原基因的質(zhì)粒DNA免疫小鼠和猴，也可使動(dòng)物產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并使動(dòng)物免受病毒攻擊。雙順反子表達(dá)載體含有核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)，因此可同時(shí)表達(dá)兩種不同的抗原。將含有乙型肝炎表面抗原和核心抗原的雙順反子表達(dá)載體免疫小鼠，小鼠可同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)這兩種抗原的免疫應(yīng)答。這為雙價(jià)及多價(jià)DNA疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。 基于以上考慮，本研究利用雙順反子表達(dá)載體pIRES構(gòu)建含登革病毒prM-E基因的雙價(jià)和四價(jià)重組質(zhì)粒DNA，并在小鼠中觀察其免疫原性，為登革多價(jià)DNA疫苗的研究提供依據(jù)。 首先，我們構(gòu)建了含登革1和3型病毒prM-E基因的雙順反子重組質(zhì)粒DNA。利用Trizol試劑從感染DEN1和DEN3的乳鼠腦中提取病毒RNA，然后分別進(jìn)行RT-PCR，得到DEN1和DEN3 prM-E基因。先將DEN3 prM-E基因插入pIRES載體IRES序列的下游，再將DEN1 prM-E基因插入IRES序列的上游，獲得雙順反子表達(dá)載體pME1-IRES-ME3。為了證明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA在真核細(xì)胞中可表達(dá)登革病毒的prM-E蛋白，將pME1-IRES-ME3以電穿孔的方法轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，通過RT-PCR在胞內(nèi)可檢測到登革病毒的特異核酸片段，通過間接免疫熒光法在細(xì)胞的胞漿中可檢測到登革1和3型病毒所特異的蛋白。利用同樣的方法構(gòu)建了含DEN2和DEN4 prM-E基因的重組質(zhì)粒pME2-IRES-ME4。含DEN1～4型病毒prM-E基因的兩個(gè)雙價(jià)重組質(zhì)粒的構(gòu)建為在小鼠中觀察其免疫原性 中文摘要 奠定了基礎(chǔ)。 為提高質(zhì)粒DNA的免疫原性，我們將含鼠源GM一CSF的質(zhì)粒 pUMCVI一mGM一CSF與pMEI一IRES一ME3和pMEZ一IRES一ME4進(jìn)行聯(lián)合免疫。接種 途徑采用肌肉多點(diǎn)注射，并在注射后立即對(duì)注射部位進(jìn)行電刺激，以提高DNA的 攝入效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒DNA免疫的小鼠在初次免疫后第4周即可檢測到 登革病毒的特異抗體(熒光效價(jià)為1:5)，隨著時(shí)間的延長，抗體效價(jià)逐漸上升，至 初次免疫后第14周，抗體效價(jià)達(dá)到最高(均為1:160)。對(duì)初次免疫后第14周的小 鼠血清測定中和抗體，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒DNA免疫的小鼠血清中和抗體效價(jià)達(dá) 卜32，而空載體PIREs免疫的小鼠則均小于1:8。從熒光抗體和中和抗體水平來看， GM一CSF在不同時(shí)間對(duì)體液應(yīng)答水平均有促進(jìn)作用。為觀察免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng) 答水平，我們于初次免疫后第47天和62天制備小鼠的脾細(xì)胞懸液，在體外用登革 1一4型滅活病毒抗原進(jìn)行刺激，4天后測定脾細(xì)胞的增殖能力(MTT法和MTS法) 及其分泌工FN鄧的水平。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒DNA免疫組小鼠脾細(xì)胞分泌的工FN寺水 平和脾細(xì)胞的刺激指數(shù)均明顯高于對(duì)照組，但GM一CSF對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的促進(jìn)作用不 明顯。另外，重組質(zhì)粒DNA對(duì)小鼠脾細(xì)胞中的cD4+、cDS+丁細(xì)胞種群比例沒有 影響。通過對(duì)免疫小鼠注射部位的肌肉進(jìn)行H巨染色，顯示GM一CSF可提高炎癥細(xì) 胞向注射部位侵潤的能力�？傊�，我們所構(gòu)建的含DENI和DEN3 PrM一E基因、DENZ 和DEN4 PrM一E基因的兩個(gè)雙價(jià)重組質(zhì)粒DNA在小鼠中均可產(chǎn)生針對(duì)相應(yīng)血清型的 特異抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，兩個(gè)雙價(jià)重組質(zhì)粒DNA經(jīng)配伍成四價(jià)質(zhì)粒DNA后，在 小鼠中同樣可產(chǎn)生針對(duì)四個(gè)血清型的免疫應(yīng)答。GM一CSF對(duì)體液免疫應(yīng)答有促進(jìn)作 用，但對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答無明顯的促進(jìn)作用。 為進(jìn)一步提高重組質(zhì)粒DNA的免疫原性，擬利用重組的病毒蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行 加強(qiáng)免疫，以提高中和抗體水平及其持續(xù)的時(shí)間。為此，在大腸桿菌中對(duì)登革2型 病毒包膜蛋白的B區(qū)(298一400氨基酸)進(jìn)行了表達(dá)。我們采用pBAD/Topo ThioF。Sion原核表達(dá)載體，結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物以可溶性為主，并且表達(dá)量約占細(xì) 菌可溶性總蛋白的62%。通過免疫印跡和EL工SA檢測表明，表達(dá)產(chǎn)物可與登革2型 病毒的特異抗體反應(yīng)，而與登革病毒其它血清型多抗無交叉反應(yīng)。包膜蛋白B區(qū)的 表達(dá)也為研制登革病毒的亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。 除了利用雙順反子載體構(gòu)建登革多價(jià)疫苗外，本研究還嘗試?yán)肈NA改組技 術(shù)構(gòu)建登革病毒的四價(jià)疫苗。由于DENI一4病毒包膜基因的同源性只有60%左右， 這給DNA改組帶來了極大的困難。我們先后采用了多種方法，如家族DNA改組 中文摘要 (幾mily DNA shuming)、暫時(shí)模板上的隨機(jī)嵌合(random ehineragenesis on transient templates，RACHITT)
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

DENI和D陽3PrM一E基因的R…I}pCRAmPlifieationofPrM一EgenesofDENIan:DNAmoleeularmarkers(DL15000)andZ:amPlifiedProduetsofPrM一EgenesofDENbyRT-PCR，resPectively組質(zhì)粒DNA的構(gòu)建EN3PrM一E基因的RT-PcR擴(kuò)增產(chǎn)物純中�？紤]到DENIPrM一E基因含有Xbal載體PIRES的IRES序列下游(陽性克一E基因插入PIRES一ME3質(zhì)粒DNA的IS一ME3)。含DENI和DEN3PrM一E基2。

FigZConstructionProeeduresofthebicistroniereeombinantPlasmidDNA雙順反子重組質(zhì)粒DNA采用PCR和酶切法進(jìn)行鑒定。以DIABF和DIABR、D3ABF和D3ABR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均可得到約2kb的特異條帶(見圖3的泳道4和5)，Mtu工和Nhel也可從質(zhì)粒上切下一條約Zkb的條帶(見圖3的泳道3)，而Xbal的酶切結(jié)果也均與預(yù)期(約7.skb、1.4kb、0.skb)一致(見圖3的

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10 記者 李強(qiáng);登革熱疫情嚴(yán)重[N];新華每日電訊;2002年

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本文編號(hào)：2720729