【摘要】：骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）在不同的誘導(dǎo)條件下，具有向中胚層和神經(jīng)外胚層組織細(xì)胞分化的能力，已成為組織工程的種子細(xì)胞。目前，許多文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于MSCs的分離、鑒定、生物學(xué)性狀及定向誘導(dǎo)分化.。隨著組織細(xì)胞工程學(xué)和基因工程學(xué)的發(fā)展，利用MSCs的多向分化潛能，在組織工程、基因治療以及器官移植等方面的應(yīng)用研究已成為研究熱點(diǎn)。然而MSCs在血管組織工程中的作用及其與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的關(guān)系的研究尚少。 MSCs具有內(nèi)皮細(xì)胞的某些表型，因此研究和分析MSCs生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和表型特征，不僅對(duì)研究血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)疾病的治療有著重要的指導(dǎo)意義，而且給血管組織工程學(xué)帶來(lái)了一次革命性轉(zhuǎn)變。MSCs作為血管組織工程的種子細(xì)胞，具有其他細(xì)胞所不可比擬的優(yōu)越性：①取材方便，損傷輕微，不必通過手術(shù)從病人身上得到自身成熟細(xì)胞，避免對(duì)病人造成不必要的二次創(chuàng)傷；②從患者本人骨髓血培養(yǎng)擴(kuò)增的MSCs誘導(dǎo)為血管內(nèi)皮細(xì)胞，不存在組織相容性問題；③體內(nèi)成熟內(nèi)皮細(xì)胞其分裂增殖能力有限，且還存在去分化形成腫瘤的傾向。MSCs具有旺盛的增殖分化潛能，無(wú)誘導(dǎo)劑情況下可保持25代內(nèi)無(wú)分化趨勢(shì)，并且MSCs在體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)作用，至今未 WP=112 見體內(nèi)發(fā)生腫瘤的報(bào)導(dǎo)；④人工合成材料的可降解性材料聚乙二醇酸PGA、聚丙醇酸PLA、聚乙醇酸PLLA，與MSCs相結(jié)合使用，將會(huì)給血管組織工程學(xué)帶來(lái)不可估量的使用前景。殖分化潛能，無(wú)誘導(dǎo)劑情況下，可保持25代內(nèi)無(wú)分化趨勢(shì)。 細(xì)胞分化程序的啟動(dòng)和進(jìn)行是多個(gè)基因有次序的開啟/關(guān)閉或表達(dá)增強(qiáng)/降低的結(jié)果，受細(xì)胞與細(xì)胞（包括間質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞等）、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互作用的影響。細(xì)胞因子在傳遞細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間、細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息中起重要作用。 Flt-1/VEGF，F(xiàn)lk-1/VEGF系統(tǒng)在內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化、內(nèi)皮細(xì)胞游走及管腔形成過程中起重要作用并且大量實(shí)驗(yàn)表明VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中起著關(guān)鍵的作用。細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變也影響干細(xì)胞的分化，胞外某些信息通過細(xì)胞外基質(zhì)傳遞給干細(xì)胞，以觸發(fā)跨膜信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞的基因表達(dá)。這一過程不僅改變干細(xì)胞的分裂方式，而且也激活干細(xì)胞的多潛能性，使干細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種定向祖細(xì)胞，以適應(yīng)組織修復(fù)的需要。 本研究擬通過免疫熒光、全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)、激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)監(jiān)控技術(shù)及三維圖象重組技術(shù)、Bodyen 小室技術(shù)、體外血管形成實(shí)驗(yàn)，從形態(tài)學(xué)、電生理等多角度逐漸深入地研究VEGF在MSCs內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中所起的作用；并利用抑制性消減雜交技術(shù)從分子水平上尋找內(nèi)皮細(xì)胞分化的機(jī)理，探討MSCs 作為血管組織工程種子細(xì)胞的可能性。 結(jié)果： 1．本實(shí)驗(yàn)在貼壁篩選與密度梯度離心法相結(jié)合的基礎(chǔ)上，傳代過程中與篩網(wǎng)過濾法結(jié)合，除去少量已分化或老化的體積較大而扁平的細(xì)胞（mMSCs），使細(xì)胞純度達(dá)95%，平均為93.26±2.48％。與以往部分研究不同，CD29陰性，CD44陽(yáng)性率達(dá)95%，說(shuō)明分離的細(xì)胞群純度較高。 WP=113 2．MSCs的細(xì)胞生物學(xué)特征及電生理特征研究甚少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MSCs中S+G2 期的細(xì)胞約占18%,而G1期的細(xì)胞為 82 % (即靜止期細(xì)胞 ) ,只有少數(shù)細(xì)胞處于活躍的增殖期。在對(duì)原代、凍存后復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)至P12的MSCs的染色體核型分析中發(fā)現(xiàn)其保持穩(wěn)定的二倍體核型且核型正常，因此，從細(xì)胞生物學(xué)角度進(jìn)一步證實(shí)MSCs有望成為穩(wěn)定培養(yǎng)的細(xì)胞系，作為細(xì)胞治療的種子細(xì)胞。 3．MSCs細(xì)胞上存在電壓依賴型鈣通道（VOCCs）。其峰值電流(ICa-Peak)在+30 - +40mV為（97.83±8.98，pA，n=8），此電流可被10uM的Nicardipine阻斷從而證實(shí)為細(xì)胞的鈣通道電流。 4．MSCs具備內(nèi)皮分化的細(xì)胞免疫學(xué)基礎(chǔ)。表達(dá)早期內(nèi)皮細(xì)胞分化標(biāo)志和EPC(內(nèi)皮前體細(xì)胞)標(biāo)志之一Flk-1，表達(dá)Flt-1，與早期內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育有關(guān)。 5．全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察VEGF作用下MSCs細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 峰值電流升高，（實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別為110.00±7.62、97.50±7.01 (p0.05),pA,n=9）。與對(duì)照組相比VEGF組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，說(shuō)明MSCs能接受VEGF刺激，引起胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生相應(yīng)變化。 6．給予VEGF165刺激，細(xì)胞內(nèi)Ca2+開始上升，經(jīng)12秒趨于平穩(wěn)，持續(xù)10秒后達(dá)到高峰，后開始下降，VEGF使細(xì)胞內(nèi)Ca2+波動(dòng)后維持在比加藥前稍高的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平上（P0.001），提示VEGF作用于MSCs后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+經(jīng)各種信號(hào)分子調(diào)節(jié)而波動(dòng)后，細(xì)胞可重新建立新的鈣平衡，即在無(wú)細(xì)胞鈣毒性前提下提高了細(xì)胞內(nèi)靜息鈣水平，而這種變化對(duì)于MSCs分化具有重要意義。 7．利用LSCM實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了MSCs在Matrigel/VEGF和Matrigel/內(nèi)皮細(xì)胞條件誘導(dǎo)液構(gòu)成的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境中的運(yùn)動(dòng)遷移情況，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞條件誘導(dǎo)液促進(jìn)MSCs的遷移，在Matrigel內(nèi)遷移的深度及遷移至聚碳酸脂 WP=114 膜下的細(xì)胞均明顯多于對(duì)照組（p〈0.05），而VEGF組遷移的深度雖高于對(duì)照組（p〈0.05），但遷移至聚碳酸脂膜下的細(xì)胞與對(duì)照組相比，并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p〉0.05），說(shuō)明MSCs在細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境遷移過程中，VEGF確實(shí)發(fā)揮一定作用，但還需其它各種復(fù)雜成分的協(xié)同參與。 8．VEGF組能夠形成管腔樣結(jié)構(gòu)，內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液組形成管腔樣
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R329
【圖文】：

35圖 1 SSH 實(shí)驗(yàn)流程圖基本過程種不同細(xì)胞(tester 和 driver)的 mRNA，反轉(zhuǎn)錄成 c切，以產(chǎn)生大小適當(dāng)?shù)钠筋^末端 cDNA 片段。

圖 2： MSCs P0、P6、P12生長(zhǎng)曲線4．細(xì)胞周期:流式細(xì)胞儀結(jié)果示 MSCs 中 S+G2的細(xì)胞為 82 % (即靜止期細(xì)胞 ) ,只有少數(shù)細(xì)胞圖 3：MSCs 細(xì)胞增殖周期

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2720638