【摘要】：腦卒中是導(dǎo)致全球人類致死致殘的主要病因之一,缺血性腦卒中是卒中的最常見(jiàn)類型,占80%-85%。腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中損傷的主要原因,而自由基的過(guò)度形成是造成腦缺血再灌注損傷的重要因素。過(guò)量自由基的產(chǎn)生主要是由于在腦缺血時(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵酶如環(huán)氧合酶、脂氧合酶、NADPH氧化酶等的激活使氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡。因此抗自由基藥物或抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵酶如環(huán)氧合酶等以減輕腦缺血再灌注損傷成為近年來(lái)研究重點(diǎn)�？棺杂苫幬镆肋_(dá)拉奉現(xiàn)已作為抗腦缺血藥物在日本與中國(guó)上市,若能篩選到同時(shí)具有抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵酶如環(huán)氧合酶、NADPH氧化酶、一氧化氮合酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等作用又有抗自由基作用的多靶點(diǎn)作用的藥物,有望成為一種更有效的抗腦缺血藥物,而抗自由基中藥,更可能具有多靶點(diǎn)作用機(jī)制,是我們篩選的主要目標(biāo)。 本課題在細(xì)胞和腦片水平上建立高效、穩(wěn)定的抗腦缺血藥物篩選模型,首先通過(guò)評(píng)價(jià)環(huán)氧合酶抑制劑在這些模型中的作用,完善藥物篩選模型；然后選擇一些文獻(xiàn)報(bào)道有神經(jīng)保護(hù)作用的抗自由基中藥,并在我們建立的模型中篩選出對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用較強(qiáng)的中藥,進(jìn)行下一步的深入研究,考察其主要作用機(jī)制,是否具有多靶點(diǎn)作用機(jī)制,分析其在臨床的應(yīng)用前景。本論文主要研究?jī)?nèi)容為： 1.在細(xì)胞、腦片模型上評(píng)價(jià)環(huán)氧合酶抑制劑塞來(lái)昔布、依托考昔及吲哚美辛對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。 2.在細(xì)胞、腦片模型上篩選抗自由基中藥,如：人參皂苷Rgl、丹皮酚、槲皮素、黃芪甲苷、白黎蘆醇、綠原酸、黃芩昔、穿心蓮內(nèi)酯、羥基紅花黃色素A和黃連解毒湯對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。 3.在上述藥物中選擇一個(gè)在細(xì)胞、腦片模型中對(duì)損傷保護(hù)作用較明顯的中藥有效成分,探討其對(duì)腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的機(jī)制,分析其臨床應(yīng)用前景。 第一部分OGD/RP誘導(dǎo)的小鼠離體腦片及PC12細(xì)胞損傷模型的建立與完善 目的在離體水平上,建立與完善缺氧缺糖再灌注(OGD/RP)誘導(dǎo)的腦片及PC12細(xì)胞損傷模型,并在這兩種模型上考察COX抑制劑對(duì)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。 方法以小鼠離體腦片建立OGD/RP模型,TTC染色檢測(cè)小鼠離體腦片的活性；同時(shí)以大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株(PC12細(xì)胞)OGD/RP損傷模型模擬腦缺血損傷,采用光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,乳酸脫氫酶(LDH)法檢測(cè)細(xì)胞死亡率,免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)。 結(jié)果在離體小鼠腦片上,COX-2選擇性抑制劑塞來(lái)昔布(Cel)及依托考昔(Eto)能減少OGD/RP引起的損傷面積,增加吸光度；而COX非選擇性抑制劑吲哚美辛(Ind)未見(jiàn)顯著性差異。在PC12細(xì)胞OGD/RP模型上,Cel、Eto及Ind均能增加OGD/RP損傷后PC12細(xì)胞存活率。其中,Eto在10-160μmol/L能顯著性增加OGD/RP誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞的存活率,并降低LDH釋放,減少PC12細(xì)胞死亡率。同時(shí)免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示Eto能抑制OGD/RP誘導(dǎo)的COX-2蛋白的表達(dá)。 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)建立的OGD/RP誘導(dǎo)的小鼠離體腦片及PC12細(xì)胞損傷模型可試用于抗腦缺血藥物的篩選；COX-2選擇性抑制劑對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用,其中新型一代的Eto在離體小鼠腦片及PC12細(xì)胞OGD/RP模型上均有顯著性的神經(jīng)保護(hù)作用,其機(jī)制可能與抑制COX-2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)。 第二部分抗自由基中藥對(duì)OGD/RP誘導(dǎo)的小鼠腦片及PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 目的在離體水平上,篩選抗自由基中藥對(duì)缺氧缺糖再灌注(OGD/RP)誘導(dǎo)的腦片及PC12細(xì)胞缺氧缺糖再灌注(OGD/RP)損傷的保護(hù)作用。 方法以小鼠離體腦片建立OGD/RP模型,TTC染色檢測(cè)小鼠離體腦片的活性；同時(shí)以大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞OGD/RP誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模擬腦缺血損傷模型,MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。以這幾個(gè)指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn),在細(xì)胞和腦片兩種損傷模型上考察文獻(xiàn)報(bào)道有神經(jīng)保護(hù)作用的抗自由基中藥,如：人參皂苷Rgl、丹皮酚、槲皮素、黃芪甲苷、白黎蘆醇、綠原酸、黃芩苷、穿心蓮內(nèi)酯、羥基紅花黃色素A和黃連解毒湯等對(duì)損傷保護(hù)作用的差別。 結(jié)果在離體小鼠腦片上,黃芪甲苷(1μmol/L)、白黎蘆醇(1.10μmol/L)、綠原酸(100μmol/L)、黃芩苷(10,100μmol/L)、羥基紅花黃色素A (1,10,100μmol/L和FE50(1μmol/L)均能減少OGD/RP引起的損傷面積,增加吸光度；而人參皂苷Rgl、丹皮酚、槲皮素、穿心蓮內(nèi)酯和FE30未見(jiàn)顯著性差異。在PC12細(xì)胞OGD/RP模型上,人參皂苷Rgl (1μmol/L)、白黎蘆醇(10μmol/L)、黃芩苷(0.1,1,10μmol/L)、穿心蓮內(nèi)酯(1μmol/L)、羥基紅花黃色素A (0.01,0.1,1,10μmol/L).FE30(1,10μmol/L)和FE50(1,10μmol/L)均能顯著性增加OGD/RP誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞的存活率,減少PC12細(xì)胞死亡率；黃芪甲苷、丹皮酚、槲皮素、綠原酸未見(jiàn)顯著性差異。 結(jié)論黃芩苷和羥基紅花黃色素A對(duì)兩種模型的OGD/RP損傷的保護(hù)作用均較強(qiáng),因此我們考慮可進(jìn)一步在PC12細(xì)胞上進(jìn)行試驗(yàn)考察其作用機(jī)制。 第三部分羥基紅花黃色素A對(duì)PC12細(xì)胞缺氧缺糖再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究 目的探討羥基紅花黃色素A(HSYA)對(duì)缺氧缺糖再灌注(OGD/RP)誘導(dǎo)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)損傷的保護(hù)作用及對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)的影響。 方法以PC12細(xì)胞OGD/RP損傷模擬腦缺血再灌注損傷,MTT法檢測(cè)PC12細(xì)胞的存活率,乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)PC12細(xì)胞死亡率,Hoechst33342檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡,細(xì)胞免疫化學(xué)法和免疫印跡法檢測(cè)PC12細(xì)胞經(jīng)OGD/RP誘導(dǎo)后COX-2表達(dá),細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)MMP-9表達(dá)。 結(jié)果OGD/RP誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷,與正常對(duì)照組相比,OGD4h-R2h組細(xì)胞存活率為(75.5士3.7)%,明顯降低(P0.01)。MTT、LDH和Hoechst33342染色結(jié)果顯示1μmol/L HSYA預(yù)處理能增加OGD/RP誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞存活率(90.8土7.6)%,降低細(xì)胞LDH釋放率(109.5士7.0)%,同時(shí)減少PC12細(xì)胞凋亡率(19.7土7.5)%,與模型組(OGD4h-R2h)相比,均具有顯著性差異(P0.01)。COX-2和MMP-9經(jīng)OGD/RP處理后均能產(chǎn)生誘導(dǎo)表達(dá),而HSYA能抑制MMP-9表達(dá)而不抑制COX-2表達(dá)。 結(jié)論HSYA在OGD/RP時(shí)預(yù)先給藥對(duì)OGD/RP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有明顯保護(hù)作用,能減少細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能是通過(guò)抑制MMP-9的誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)。HSYA作為活血化瘀藥預(yù)防給藥可能減少中風(fēng)的發(fā)生減輕神經(jīng)損傷。
【學(xué)位授予單位】：浙江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R-332;R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2720465