【摘要】：蛋白質(zhì)在胞漿內(nèi)合成以后必須被運輸?shù)教囟ǖ奈恢貌拍馨l(fā)揮其功能，這個過程稱為蛋白質(zhì)的分揀(protein sorting)，該過程的實現(xiàn)依賴于蛋白質(zhì)內(nèi)部特定的序列組成——分選信號(sorting signal)，如分泌性蛋白的分泌過程有賴于蛋白質(zhì)氨基端的前導肽(leader peptide)的介導。根據(jù)蛋白質(zhì)的這種性質(zhì)，科學家們發(fā)展了一些有效的基因克隆系統(tǒng)，如信號肽捕獲系統(tǒng)(signal sequence trap system,SST)[1，2]；核定位信號篩選系統(tǒng)(Nuclear localization signal trap system,NLST)[3，4]等。 在以往的工作中，我們建立了suc2信號肽捕獲(suc2-SST)系統(tǒng)[5]；并用所建立的系統(tǒng)對11天的小鼠胚胎cDNA文庫進行篩選。初步的實驗結(jié)果表明：用該系統(tǒng)可以有效的進行分泌性蛋白的篩選[6]。 然而在工作中我們也發(fā)現(xiàn)，雖然相對于其他的信號肽捕獲系統(tǒng)來說，用該系統(tǒng)進行分泌性蛋白分子的篩選具有相對較高的效率，但是伴隨著后基因組時代的到來，大規(guī)模cDNA測序計劃的實施，生物信息技術(shù)的快速發(fā)展，包括小鼠在內(nèi)的多種模式生物的基因已被(或?qū)⒈?迅速鑒定，仍然使用單純的生物學技術(shù)進行功能未知的分泌性蛋白分子的鑒定是很不經(jīng)濟的一種做法。本研究嘗 試將傳統(tǒng)的生物學技術(shù)(:ucZ一SST)與新興的生物信息學技術(shù)結(jié)合起來，用于 分泌性蛋白分子的大規(guī)模篩選。該方法首先從公共數(shù)據(jù)庫中尋找用于分析的候 選蛋白分子;然后選用兩種發(fā)展相對完善的生物信息學預測程序?qū)钸x序列進 行信號膚和亞細胞定位的預測分析，篩選可能的分泌性蛋白分子;最后用 sucZ一SST對預測得到的分子在酵母中進行驗證。 預實驗中，用計算機從1000多個候選的小鼠假想蛋白(勿Pothetical protein)中得到了50個可能的分泌性蛋白分子，從中隨機挑選13個分子用sucZ 信號肚捕獲系統(tǒng)進行驗證，結(jié)果顯示所有的分子都各含有一個有功能的信號 膚，進一步在哺乳動物細胞中，用激光共聚焦顯微鏡觀察了其中兩個分子 (HYP32、HYP36)的亞細胞定位，證明這兩個分子都定位于細胞分泌途徑中。 提示用計算機分析結(jié)合sucZ一SST的策略是一種可靠的方法，可以用于分泌性 蛋白分子的大規(guī)模、快速鑒定。 為了進行分泌性蛋白分子的自動化預測分析，我們與同事合作編寫了一個 整合的綜合分析平臺，并對現(xiàn)有公共數(shù)據(jù)庫中的小鼠假想蛋白(勿Pothetical protein)進行了系統(tǒng)的分析，從47716條序列中共得到1329個分子攜帶有潛 在的信號膚序列，占所有分析序列的2.8%左右。 進一步對HYP36和HYP32進行了深入的分析。HYP36基因定位于小鼠第 17號染色體C區(qū)，約7.Okb，由n個外顯子組成，可以轉(zhuǎn)錄生成至少4種轉(zhuǎn)錄 本。所編碼的蛋白質(zhì)多膚N端含有一個24aa的疏水性信號膚，膚鏈中含有一個 保守的M6P受體結(jié)構(gòu)域，2個N一linked的糖基化位點，序列同源性檢索提示該 分子為小鼠N一乙酞葡萄糖氨基一1一磷酸轉(zhuǎn)移酶Y亞單位 [GlcNAe一l一hosPhotransferase r ehain(GenBank aeeession no.壟叢絲絲肚)』， 該基因廣泛表達小鼠各種組織、細胞;亞細胞定位分析顯示，該分子主要定位 于高爾基器;轉(zhuǎn)染NIH一3T3細胞可以誘導細胞產(chǎn)生I一細胞(hiclusion Cells)表 型:相差顯微鏡觀察可見細胞中有很多胞質(zhì)小泡，亞細胞結(jié)構(gòu)觀察顯示細胞內(nèi) 出現(xiàn)大量脂滴，溶酶體大量增生，生化指標檢測顯示細胞內(nèi)溶酶體酶(刀一葡 —流。印4件解九￡了粼‘而‘夕姍血a拓‘。麟如愉“田勿‘口 排班一舉四軍互大學俘士學徒論文2004萬5 萄糖醛酸昔酶和刀一半乳糖昔酶)的含量降低，細胞培養(yǎng)上清中溶酶體酶的含 量上升，提示HYP36可能參與了細胞內(nèi)溶酶體酶的分選過程。 既往研究表明人N一乙酞葡萄糖氨基一1一磷酸轉(zhuǎn)移酶Y亞單位的突變可以導 致mC型粘脂病(mucollpidosis)的發(fā)生，病人的成纖維細胞中含有很多細胞質(zhì) 小泡，小泡中有大量的未被消化的大分子，這些大分子在正常情況下是由溶酶 體降解的.由于N一乙酞葡萄糖氨基一1一磷酸轉(zhuǎn)移酶Y亞單位的突變使得溶酶體 酶分子上的甘露糖不能夠被磷酸化，導致大多數(shù)溶酶體酶(依賴于M6PR進行 分選)不能正確地進入溶酶體，從而分泌到細胞外。最終導致卜細胞表型的產(chǎn) 生以及外周血中溶酶體酶的水平升高，這與本研究中過表達的結(jié)果十分相似 [7];本研究的結(jié)果提示對于mC型粘脂病進行基因治療時，除了要考慮常規(guī) 基因治療可能遇到的問題外，還要考慮諸如如何有效的控制N一乙酸葡萄糖氨 基一1一磷酸轉(zhuǎn)移酶Y亞單位的表達水平以及選擇哪種剪切拼接體進行表達的問 題。 HYP32基因定位于小鼠第17號染色體長臂A3.3區(qū)，全長約12.0kb，含 有6個外顯子，至少可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生4種轉(zhuǎn)錄本。所編碼的蛋白質(zhì)分子為I型跨 膜分子，N末端含有一段疏水性信號膚，胞外段含有一個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域， 包內(nèi)段由44氨基酸組成，沒有發(fā)現(xiàn)ITIM、ITAM結(jié)構(gòu)域。同源性檢索提示 HYP32與小鼠TREM3分子有較高的同源性，因此命名為mTLT3(TREMslike transc如t3)。亞細胞定位顯示HYP32定位于分泌途徑，N。找hem Blot顯示 H仰32主要表達于脾臟和肝臟組織，Rl’- PCR結(jié)果表明HYP32在腎臟、肺臟、 心臟和小腸也有低水平的表達，但在兩種單核/巨噬
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：Q51
【圖文】：

蔗糖培養(yǎng)基中生長依賴于:ucZ基因編碼的蔗糖轉(zhuǎn)換酶(invertase)向細胞外的分泌，所以篩選的指標是:酵母的存活與否。用該方法進行篩選，方法簡單，容易操作，效率很高(圖1一2)【巧，16]。我們實驗室在這方面也進行了一些有益的嘗試，建立并驗證了sucZ一SST[5，171，對cDNA文庫的篩選也得到了一些結(jié)果，證明酵母SST系統(tǒng)是一個有效的信號膚篩選系統(tǒng)。并且發(fā)現(xiàn)一些非編碼.州A也有可能直接參與蛋白質(zhì)向細胞外分泌的過程[6，18]。不過在工作中，我們也發(fā)現(xiàn)酵母系統(tǒng)的一些問題，比如篩選的假陽性率偏高

實驗流程圖

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 林邦和,朱舜麗;溶酶體病的基礎與臨床研究進展[J];安徽中醫(yī)學院學報;1993年02期

2 劉莉;溶酶體的形成與作用及其研究近況[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2003年03期

本文編號：2720426