發(fā)布時(shí)間：2020-06-18 15:36

【摘要】： 背景 目前研究認(rèn)為，microRNAs(miRNAs)廣泛參與了機(jī)體多種生理、病理過(guò)程的調(diào)控，miRNAs已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。MicroRNA-21(MiRNA-21)作為一種具有顯著抗癌細(xì)胞凋亡作用的特殊miRNA，在腫瘤領(lǐng)域尤其引人關(guān)注。MiRNA-21通過(guò)對(duì)其重要靶基因程序化細(xì)胞死亡分子4(PDCD4)的調(diào)節(jié)是miRNA-21發(fā)揮抗癌細(xì)胞凋亡作用的重要機(jī)制之一。近年發(fā)現(xiàn)miRNA-21在血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞中也存在miRNA-21的表達(dá)。MiRNA-21通過(guò)調(diào)節(jié)PDCD4的表達(dá)參與了血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞的凋亡、增殖及對(duì)抗氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷等重要過(guò)程，提示miRNA-21及其靶基因PDCD4可能在心血管領(lǐng)域具有重要的生物學(xué)作用。但miRNA-21在血管內(nèi)皮中的表達(dá)、調(diào)節(jié)和功能目前尚不清楚。糖尿病狀態(tài)下高濃度葡萄糖引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加和細(xì)胞功能受損，導(dǎo)致內(nèi)皮屏障破壞被認(rèn)為是糖尿病誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。MiRNA-21的表達(dá)調(diào)節(jié)是否參與了糖尿病狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡損傷過(guò)程目前未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。 目的 研究miRNA-21在高濃度葡萄糖作用下血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)變化情況，探討miRNA-21是否通過(guò)調(diào)節(jié)PDCD4的表達(dá)參與了高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡損害過(guò)程。 方法 (1)用不同濃度D一葡萄糖(5．5mM、11mM、22mM及33 mM)孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)48小時(shí)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)和PDCD4、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA表達(dá)情況；用Western blot方法檢測(cè)PDCD4、Bax及Bcl-2蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)變化；用分光光度計(jì)法檢測(cè)HUVECs中的Caspase-3的活性變化；Hoechst33342／PI雙熒光染色觀察細(xì)胞凋亡；MTT法檢測(cè)不同濃度葡萄糖作用下HUVECs的增殖情況。 (2)HUVECs中miRNA-21干擾抑制實(shí)驗(yàn)： 用脂質(zhì)體Lipofectamine~(TM) 2000將不同濃度的miRNA-21抑制劑2’OMe-miRNA-21(分別為3nM、10 nM、30 nM及100 nM)轉(zhuǎn)染到低血清OPTI-MEM培養(yǎng)基孵育的HUVECs中，5h后換含33mM葡萄糖DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)miPNA-21干擾抑制48小時(shí)后HUVECs中miRNA-21表達(dá)和PDCD4、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA表達(dá)情況；Western bolt法檢測(cè)PDCD4、Bcl-2及Bax的蛋白表達(dá)水平；用分光光度計(jì)法檢測(cè)HUVECs中的Caspase-3的活性變化；Hoechst33342／PI雙熒光染色觀察細(xì)胞凋亡；MTT法檢測(cè)HUVECs的增殖情況。 (3)HUVECs中miRNA-21過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)： 用脂質(zhì)體Lipofectamine~(TM) 2000將10nM和30hM的miRNA-21模擬物轉(zhuǎn)染到低血清OPTI-MEM I培養(yǎng)基孵育的HUVEECs中，5h后換含5．5mM或33mM葡萄糖的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢miRNA-21過(guò)表達(dá)48小時(shí)后HUVECs中miRNA-21表達(dá)和PDCD4、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA表達(dá)情況；Westernbolt法檢測(cè)PDCD4、Bcl-2及Bax的蛋白表達(dá)水平；用分光光度計(jì)法檢測(cè)HUVECs中的Caspase-3的活性變化；Hoechst33342／PI雙熒光染色觀察細(xì)胞凋亡；MTT法檢測(cè)HUVECs的增殖情況。 結(jié)果 (1)隨著葡萄糖濃度(5．5mM、11mM、22mM及33 mM)的增加，HUVECs中miRNA-21的表達(dá)水平呈濃度依賴(lài)性降低(p0．01)，PDCD4的蛋白表達(dá)水平增加(p0．05)，但對(duì)PDCD4的mRNA表達(dá)無(wú)影響(p0．05)：高濃度葡萄糖呈濃度依賴(lài)性下調(diào)HOVECs中Bcl一2的mRNA及蛋白表達(dá)水平(p0．05)，同時(shí)上調(diào)Bax的ⅢRNA及蛋白表達(dá)(p0．05)，Bax／Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)比值也明顯增加(p0．01)；高濃度葡萄糖呈濃度依賴(lài)性升高Caspase-3的mRNA表達(dá)和Caspase-3活性水平(p0．05)，細(xì)胞凋亡增加(p0．05)，同時(shí)降低細(xì)胞增殖活性水平(p0．05)。 (2)10nM、30nM及100nM／的2’OMe-miRNA-21呈濃度依賴(lài)性明顯降低33nM葡萄糖孵育的HUVECs中miRNA-21的表達(dá)(P0．01)，明顯上調(diào)PDCD4的蛋白表達(dá)水平(p0．01)，而不同濃度miRNA-21抑制物對(duì)33mM葡萄糖孵育的HUVECs中PDCD4的mP,NA表達(dá)無(wú)影響(p0．05)。 (3)10nM、30nM及100nM的2’OMe-miRNA-21呈濃度依賴(lài)性降低33mM葡萄糖孵育的HUVECs中Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)(p0．05)；顯著增加Bax的mRNA及蛋白表達(dá)(p0．01)，Bax／Bci-2的mRNA及蛋白表達(dá)比值明顯升高(p0．01)。顯著升高Caspase-3的mP,NA表達(dá)和Caspasel3活性(p0．01)，細(xì)胞凋亡明顯增加(p0．01)，同時(shí)降低細(xì)胞增殖水平(p0．05)。 (4)10nM和30nM的miRNA-21模擬物均明顯增加5．5mM或33mM葡萄糖孵育下HUVECs中miRNA-21表達(dá)水平(p0．01)，顯著降低PDCD4的蛋白表達(dá)(p0．01)，但對(duì)不影響PDCD4的mRNA表達(dá)水平(p0．05)。相同劑量的miRNA-21模擬物引起33mM葡萄糖孵育下HUVECs中miP,NA-21及PDCD4蛋白表達(dá)的變化程度強(qiáng)于5．5mM葡萄糖孵育下HUVECs中相關(guān)指標(biāo)的變化(p0．05)。 (5)30nM的miRNA-21模擬物明顯上調(diào)5．5mM和33mM葡萄糖孵育下HUVECs中Bcl-2的mP,NA及蛋白表達(dá)水平(p0．01)，同時(shí)下調(diào)Bax的mRNA及蛋白表達(dá)(p0．01)，Bax／Bel-2的mRNA和蛋白表達(dá)比值顯著降低(p0．01)。細(xì)胞中Caspase-3的mP,NA表達(dá)和Caspase-3的活性水平明顯減少(p0．01)。細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少(p0．01)，而細(xì)胞增殖活性增加(p0．05)。30nM的miRNA-21模擬物對(duì)33mM葡萄糖孵育下HUVECs中Bax／Bcl-2的mIWA和蛋白表達(dá)比值、Caspase-3的mP,NA表達(dá)、Caspase-3的活性、凋亡細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞增殖活性水平的變化程度影響均低于5．5mM葡萄糖孵育下HUVECs中相關(guān)指標(biāo)的變化(p0．05)。 結(jié)論 (1)高濃度葡萄糖可降低血管內(nèi)皮細(xì)胞中miP,NA-21表達(dá)水平，同時(shí)增加PDCD4的蛋白表達(dá)。MiP,NA-21通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制的方式調(diào)節(jié)PDCD4的表達(dá)，PDCD4是血管內(nèi)皮細(xì)胞中miRNA-21的重要作用靶基因。 (2)MiP,NA-21通過(guò)調(diào)節(jié)PDCD4表達(dá)參與了高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡過(guò)程，并影響細(xì)胞的增殖。 (3)MiRNA-21在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)變化可影響B(tài)ax／Bcl-2系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)的平衡，miRNA-2l與Bax／Bcl-2體系可能共同參與了高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)程。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R363
【圖文】：

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本文編號(hào)：2719471