【摘要】：單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)主要引起生殖器皰疹。近年來(lái)，生殖器皰疹的發(fā)病率在迅速上升，危害性亦日益顯得突出，但目前尚無(wú)特效藥控制其發(fā)生和復(fù)發(fā)，因此研制皰疹病毒疫苗已成為預(yù)防生殖器皰疹感染的關(guān)鍵。在現(xiàn)已研制的疫苗中，DNA疫苗盡管誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答效力較低，可因其具有制備簡(jiǎn)單、安全、誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答廣泛長(zhǎng)久，并且可以共表達(dá)免疫調(diào)節(jié)因子，根據(jù)需要誘導(dǎo)產(chǎn)生最適免疫應(yīng)答等特性，受到人們的青睞。近幾年來(lái)，國(guó)外學(xué)者們一直在探索應(yīng)用分子佐劑來(lái)加強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果，并取得了一定的成效。為構(gòu)建有效預(yù)防HSV-Ⅱ的DNA疫苗，探討分子佐劑對(duì)DNA疫苗的作用機(jī)制，本研究完成了以下工作： 1．HSV-Ⅱ gD DNA疫苗的構(gòu)建：根據(jù)GenBank中HSV-Ⅱ HG52株gD基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，采用PCR方法擴(kuò)增出HSV-Ⅱ Sav株gD全部編碼區(qū)的基因片段，經(jīng)中介pUCm-T載體，將其插入到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3中相應(yīng)的位點(diǎn)，并轉(zhuǎn)化E．coli DH5α，構(gòu)建出HSV-Ⅱ gD DNA疫苗。通過(guò)PCR、酶切和測(cè)序鑒定，證明gD基因片段在pcDNA3中插入正確，并將構(gòu)建出的重組質(zhì)粒命名為Pg。經(jīng)原位ELISA法證實(shí)，Pg在COS-7細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的蛋白能夠與gD單克隆抗體結(jié)合，這表明所構(gòu)建的Pg DNA疫苗能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。 2．小鼠趨化因子MIP-1α重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：首先用細(xì)菌脂多糖 天津醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文 (LPS)刺激RAW264.7細(xì)胞，提取總RNA，然后應(yīng)用RT一PCR方法，擴(kuò)增出MIP一1 �；虻娜烤幋a序列。經(jīng)中介pucm一T載體和Hindln、Xbal雙酶切處理后， 將其插入到用相同酶切的真核表達(dá)質(zhì)粒peDNA3中，并轉(zhuǎn)化E.coh DHS“。通 過(guò)PCR、酶切和測(cè)序鑒定，證明MIP一la基因片段在PcDNA3中插入正確， 并將構(gòu)建出的重組質(zhì)粒命名為Pm。經(jīng)RT一PCR和Boyden趨化小室法鑒定，證 實(shí)了所構(gòu)建的Pm在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能夠表達(dá)具有生物學(xué)活性的MIP一1。。 3.pg+pm DNA疫苗對(duì)小鼠的初步免疫觀察:每次用200林g/200林1 peDNA3、 Pg、Pg十Pm和等體積生理鹽水(NS)肌肉注射免疫BALB/C小鼠，連續(xù)免疫3 次，末次免疫后一個(gè)月用IOOLDS。病毒量進(jìn)行陰道內(nèi)攻擊。結(jié)果表明Pg+Pm疫 苗組的存活率(86.7%)明顯高于Pg疫苗組的(53.3%);通過(guò)陰道組織病理切 片和半定量積分分析，證明了Pg+Pm疫苗比Pg疫苗明顯降低了小鼠的發(fā)病率。 為探討Pg+Pm DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，于末次免疫后第二周及第四周 收集小鼠血清和脾細(xì)胞，采用微量細(xì)胞中和試驗(yàn)和EL工SA法檢測(cè)血清特異性抗 體，采用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)檢測(cè)脾T細(xì)胞增殖反應(yīng)程度。結(jié)果顯示Pg+Pm DNA 疫苗沒(méi)有比Pg DNA疫苗誘導(dǎo)出更高的特異性抗體，但脾T細(xì)胞增值反應(yīng)程度 明顯高于Pg疫苗組的，表明Pg+Pm DNA疫苗誘導(dǎo)了更高的細(xì)胞免疫應(yīng)答。 綜上所述，本研究以HSv一H gD和M護(hù)一1。成功構(gòu)建了預(yù)防HSv一H感染 的DNA疫苗。動(dòng)物初步免疫發(fā)現(xiàn)，gD加MIP一1。的DNA疫苗免疫效應(yīng)優(yōu)于單 獨(dú)的gD DNA疫苗，可以顯著地提高小鼠的保護(hù)率和降低發(fā)病率。提示以 MIP一1。作為分子佐劑的HSV一H DNA疫苗具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【圖文】：

Hsv一IlgnPeR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠arkerDL2000:2000，1000，751gDPCR產(chǎn)物segeleleetroPhoresisofHSV一IlgDrkerDL2000:2000，1000，75gDPCRProduet體的構(gòu)建與鑒定:物經(jīng)回收純化后，插入pUC青霉素平板篩選后，PCR、酶

2Hsv一ngD基因克隆載體的PcR、酶切鑒4Idigest:19329，7743，6223，4254，3472，2690，;T/gD經(jīng)Hindlll酶切:T/gD經(jīng)Hind川酶切;T/gD經(jīng)xbal酶切;gD經(jīng)xbal酶切。etionendonueleasesanalysisofthereeombinantIdigest:19329，7743，6223，4254，3472，2690，uet:endonueleasesanalysisofPUCm一T/gDinse

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2719195