【摘要】： 當(dāng)今社會，人口老齡化已成為社會問題，老年醫(yī)學(xué)及抗衰老研究倍受推崇，尋求行之有效的抗衰老措施、提高生存質(zhì)量成為當(dāng)務(wù)之急。近年的研究證實，作為神經(jīng)內(nèi)分泌器官的松果體，其分泌的多肽及吲哚激素，尤其是褪黑素(melatonin，MT)除參與生殖反應(yīng)、炎癥免疫反應(yīng)、疼痛、睡眠等機(jī)體調(diào)節(jié)作用外，尚有顯著的自由基清除性抗衰老功效，因而外源性MT的攝入已成為治療老年性疾病的手段之一，但目前運用的外源性MT臨床療效遠(yuǎn)不近人意，其毒副作用尚缺乏明確的統(tǒng)計及檢測。采用組織工程技術(shù)體外構(gòu)建松果體組織并植入體內(nèi)，發(fā)揮其分泌功能，替代因松果體鈣化性MT和其他多肽激素的血漿低濃度及由此引發(fā)的一系列衰老過程，同時避免應(yīng)用外源性MT的單一療效及其毒副作用，應(yīng)不失為一種有前景的抗衰老手段。本課題從這一目標(biāo)入手，進(jìn)行了松果體細(xì)胞的體外培養(yǎng)、微囊包裹研究，探討松果體細(xì)胞微囊移植對MT低血漿濃度的改善情況，為采用組織工程技術(shù)對抗衰老提供基本的實驗和技術(shù)手段。 材料和方法 (1)．采用膠原酶、胰酶兩步消化法獲取分散的SD乳鼠松果體細(xì)胞懸液，接種、培養(yǎng)，相差顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁、生長及其形態(tài)、結(jié)構(gòu)特點，建立松果體細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。 (2)．采用MTT法、BrdU摻入、5-HT免疫細(xì)胞化學(xué)法，HPLC、透射電鏡、RT-PCR等技術(shù)分析松果體細(xì)胞在體外不同培養(yǎng)時間段的增殖、分化及功能表達(dá)，分析松果體細(xì)胞的生物學(xué)特性，探尋松果體細(xì)胞體外擴(kuò)增與功能分化的最佳時機(jī)。 (3)．采用共軸氣流噴射技術(shù)，alginate-poly-l-lysine-alginate(APA)微囊包裹松果體細(xì)胞，體外培養(yǎng)，分析松果體細(xì)胞微囊的生物學(xué)特性、免疫隔離效應(yīng)及囊內(nèi)細(xì)胞的功能狀態(tài)。 (4).分別采用體外培養(yǎng)及直接消化分離的松果體細(xì)胞進(jìn)行微囊 化處理，分析比較不同來源松果體微囊的功能差異，篩選耐 受性、適應(yīng)性、活性良好的種子細(xì)胞用于微囊移植研究。 (5).制備去松果體大鼠模型，檢測術(shù)后MT血漿濃度的動態(tài)變化， 評價并明確松果體微囊移植的最佳時機(jī)。 (6).進(jìn)行松果體細(xì)胞微囊的移植實驗，‘探討回收微囊及囊內(nèi)細(xì)胞 的形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化，動態(tài)分析移植組與對照組以及不同移植 時間的MT變化情況，評價松果體細(xì)胞微囊在體內(nèi)的功能發(fā) 揮、免疫屏蔽及其生物相容性。 結(jié)果 (1).兩步消化分離及普通的體外培養(yǎng)條件下(DMEM一F12，含 10%FBS)，松果體細(xì)胞貼壁、生長旺盛，原代細(xì)胞的良好生 存狀態(tài)可達(dá)6Od。 (2).細(xì)胞學(xué)鑒定確認(rèn)90%的培養(yǎng)細(xì)胞為松果體細(xì)胞，細(xì)胞的生長 倍增時間為第gd，第lld達(dá)高峰;松果體細(xì)胞的體外功能狀 態(tài)呈逐漸恢復(fù)趨勢，MT的分泌量于第2周開始增加，第3 周達(dá)高峰，隨后緩慢下降。培養(yǎng)細(xì)胞具備功能活躍細(xì)胞的超 微結(jié)構(gòu)特征，一月齡原代細(xì)胞仍明顯可見胞質(zhì)分泌顆粒，凝 膠電泳檢測證實培養(yǎng)細(xì)胞MT合成限速酶NAT的表達(dá)如常。 (3).氣流噴射法(l .SBar氣壓)獲得直徑400一700um的圓形APA 松果體細(xì)胞微囊，囊內(nèi)細(xì)胞存活良好，釋放后仍能迅速貼壁 生長，HPLC檢測證實微囊化松果體細(xì)胞MT分泌功能旺盛， 對腎上腺素能激動劑作用敏感:淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗明確了松 果體微囊的免疫隔離效應(yīng)。 (4).直接消化分離獲取種子細(xì)胞操作簡便，但體外培養(yǎng)的松果體 細(xì)胞與微囊材料有更好的組織相容性和分泌活性，宜選擇培 養(yǎng)后包裹的松果體微囊進(jìn)行移植研究。 (5).大鼠行松果體摘除后血漿MT水平迅速下降，術(shù)后第3d末 降至正常血濃度的1/2，15d后夜間血漿MT值難以檢測。 (6).松果體微囊及對照組(非微囊松果體細(xì)胞懸液)移植術(shù)后24h 均可檢測到MT，并出現(xiàn)晝低夜高節(jié)律的部分恢復(fù)現(xiàn)象。15 (l) (2) (3) (4) (5) d后對照組的MT值難以檢測，而松果體微囊移植鼠的平均 MT值陽性時間較對照組明顯延長，能維持平穩(wěn)的分泌功能 約2周，隨后緩慢下降，1月時僅測得微量的MT，45d后微 囊及對照組的血MT值檢測均為陰性。 結(jié)論 常規(guī)消化及普通體外培養(yǎng)條件下，大鼠松果體細(xì)胞貼壁、生 長狀態(tài)良好，確保了體外操作以及篩選活力、生長、功能穩(wěn) 定的種子細(xì)胞的可行性。 1一7d齡乳鼠松果體原代細(xì)胞體外增殖、生長能力旺盛，功能 表達(dá)于培養(yǎng)第1周末開始恢復(fù)，第2一3周間最為活躍，可作 為微囊包裹的最佳時間段。 噴射法能獲得完整的APA松果體細(xì)胞微囊，所得微囊形態(tài)、 直徑及包含的細(xì)胞數(shù)量基本符合實驗要求，囊內(nèi)細(xì)胞的活性 及功能在一定時間內(nèi)能保持生理狀態(tài)，微囊具備良好的免疫 隔離效應(yīng)和生物相容性。囊內(nèi)細(xì)胞于包裹24h后即有分泌功 能，可立刻進(jìn)行移植實驗。 松果體完全摘除后動物呈現(xiàn)長期的MT低血漿濃度，是研究 松果體激素效應(yīng)的理想模型。建議術(shù)后15d為較佳的移植及 實驗時1’日」。 松果體細(xì)胞微囊移植在短期內(nèi)能有效提高異品系模型動物的 血漿MT水平，同時部分恢復(fù)其生理性晝夜節(jié)律，說明APA 松果體微囊具備良好的免疫保護(hù)效應(yīng)及生物相容性，采
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R329
【圖文】：

無菌條件下剝離顱骨，游離松果體并置于冷D一hank’S液中，顯微解剖鏡下徹底剝除外膜及血管(圖1).置冷D一hank’S液洗滌并剪碎，0.10，0膠原酶消化Zomin、0.250，0胰酶消化lomin后，血清中和，反復(fù)吹打，離心棄上清，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基反復(fù)吹打，制成細(xì)胞懸液，按1x105/ml的細(xì)胞密度接種于25ml培養(yǎng)瓶，靜置培養(yǎng)。將培養(yǎng)1周的部分細(xì)胞胰酶消化

圖4.培養(yǎng)2周后旺盛生長的松果體細(xì)胞(x100)(四)討論一砂松果體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)是體外研究構(gòu)建。哺乳動物松果體體外培養(yǎng)早在70年代已有報道織[30]及細(xì)胞13‘、32]的培養(yǎng)技術(shù)。為了尋求能良好研究體系，國外學(xué)者多致力于松果體的細(xì)胞

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2718870