組織工程化人工松果體-大鼠松果體細胞微囊的實驗研究

發(fā)布時間：2020-06-18 06:55

【摘要】： 當今社會，人口老齡化已成為社會問題，老年醫(yī)學及抗衰老研究倍受推崇，尋求行之有效的抗衰老措施、提高生存質量成為當務之急。近年的研究證實，作為神經內分泌器官的松果體，其分泌的多肽及吲哚激素，尤其是褪黑素(melatonin，MT)除參與生殖反應、炎癥免疫反應、疼痛、睡眠等機體調節(jié)作用外，尚有顯著的自由基清除性抗衰老功效，因而外源性MT的攝入已成為治療老年性疾病的手段之一，但目前運用的外源性MT臨床療效遠不近人意，其毒副作用尚缺乏明確的統計及檢測。采用組織工程技術體外構建松果體組織并植入體內，發(fā)揮其分泌功能，替代因松果體鈣化性MT和其他多肽激素的血漿低濃度及由此引發(fā)的一系列衰老過程，同時避免應用外源性MT的單一療效及其毒副作用，應不失為一種有前景的抗衰老手段。本課題從這一目標入手，進行了松果體細胞的體外培養(yǎng)、微囊包裹研究，探討松果體細胞微囊移植對MT低血漿濃度的改善情況，為采用組織工程技術對抗衰老提供基本的實驗和技術手段。材料和方法 (1)．采用膠原酶、胰酶兩步消化法獲取分散的SD乳鼠松果體細胞懸液，接種、培養(yǎng)，相差顯微鏡觀察細胞貼壁、生長及其形態(tài)、結構特點，建立松果體細胞體外培養(yǎng)體系。 (2)．采用MTT法、BrdU摻入、5-HT免疫細胞化學法，HPLC、透射電鏡、RT-PCR等技術分析松果體細胞在體外不同培養(yǎng)時間段的增殖、分化及功能表達，分析松果體細胞的生物學特性，探尋松果體細胞體外擴增與功能分化的最佳時機。 (3)．采用共軸氣流噴射技術，alginate-poly-l-lysine-alginate(APA)微囊包裹松果體細胞，體外培養(yǎng)，分析松果體細胞微囊的生物學特性、免疫隔離效應及囊內細胞的功能狀態(tài)。 (4).分別采用體外培養(yǎng)及直接消化分離的松果體細胞進行微囊化處理，分析比較不同來源松果體微囊的功能差異，篩選耐受性、適應性、活性良好的種子細胞用于微囊移植研究。 (5).制備去松果體大鼠模型，檢測術后MT血漿濃度的動態(tài)變化，評價并明確松果體微囊移植的最佳時機。 (6).進行松果體細胞微囊的移植實驗，‘探討回收微囊及囊內細胞的形態(tài)、結構變化，動態(tài)分析移植組與對照組以及不同移植時間的MT變化情況，評價松果體細胞微囊在體內的功能發(fā) 揮、免疫屏蔽及其生物相容性。結果 (1).兩步消化分離及普通的體外培養(yǎng)條件下(DMEM一F12，含 10%FBS)，松果體細胞貼壁、生長旺盛，原代細胞的良好生存狀態(tài)可達6Od。 (2).細胞學鑒定確認90%的培養(yǎng)細胞為松果體細胞，細胞的生長倍增時間為第gd，第lld達高峰;松果體細胞的體外功能狀態(tài)呈逐漸恢復趨勢，MT的分泌量于第2周開始增加，第3 周達高峰，隨后緩慢下降。培養(yǎng)細胞具備功能活躍細胞的超微結構特征，一月齡原代細胞仍明顯可見胞質分泌顆粒，凝膠電泳檢測證實培養(yǎng)細胞MT合成限速酶NAT的表達如常。 (3).氣流噴射法(l .SBar氣壓)獲得直徑400一700um的圓形APA 松果體細胞微囊，囊內細胞存活良好，釋放后仍能迅速貼壁生長，HPLC檢測證實微囊化松果體細胞MT分泌功能旺盛，對腎上腺素能激動劑作用敏感:淋巴細胞轉化實驗明確了松果體微囊的免疫隔離效應。 (4).直接消化分離獲取種子細胞操作簡便，但體外培養(yǎng)的松果體細胞與微囊材料有更好的組織相容性和分泌活性，宜選擇培養(yǎng)后包裹的松果體微囊進行移植研究。 (5).大鼠行松果體摘除后血漿MT水平迅速下降，術后第3d末降至正常血濃度的1/2，15d后夜間血漿MT值難以檢測。 (6).松果體微囊及對照組(非微囊松果體細胞懸液)移植術后24h 均可檢測到MT，并出現晝低夜高節(jié)律的部分恢復現象。15 (l) (2) (3) (4) (5) d后對照組的MT值難以檢測，而松果體微囊移植鼠的平均 MT值陽性時間較對照組明顯延長，能維持平穩(wěn)的分泌功能約2周，隨后緩慢下降，1月時僅測得微量的MT，45d后微囊及對照組的血MT值檢測均為陰性。結論常規(guī)消化及普通體外培養(yǎng)條件下，大鼠松果體細胞貼壁、生長狀態(tài)良好，確保了體外操作以及篩選活力、生長、功能穩(wěn) 定的種子細胞的可行性。 1一7d齡乳鼠松果體原代細胞體外增殖、生長能力旺盛，功能表達于培養(yǎng)第1周末開始恢復，第2一3周間最為活躍，可作為微囊包裹的最佳時間段。噴射法能獲得完整的APA松果體細胞微囊，所得微囊形態(tài)、直徑及包含的細胞數量基本符合實驗要求，囊內細胞的活性及功能在一定時間內能保持生理狀態(tài)，微囊具備良好的免疫隔離效應和生物相容性。囊內細胞于包裹24h后即有分泌功能，可立刻進行移植實驗。松果體完全摘除后動物呈現長期的MT低血漿濃度，是研究松果體激素效應的理想模型。建議術后15d為較佳的移植及實驗時1’日」。松果體細胞微囊移植在短期內能有效提高異品系模型動物的血漿MT水平，同時部分恢復其生理性晝夜節(jié)律，說明APA 松果體微囊具備良好的免疫保護效應及生物相容性，采
【學位授予單位】：中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R329
【圖文】：

松果體,大鼠,胰酶消化,血清中和

無菌條件下剝離顱骨，游離松果體并置于冷D一hank’S液中，顯微解剖鏡下徹底剝除外膜及血管(圖1).置冷D一hank’S液洗滌并剪碎，0.10，0膠原酶消化Zomin、0.250，0胰酶消化lomin后，血清中和，反復吹打，離心棄上清，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基反復吹打，制成細胞懸液，按1x105/ml的細胞密度接種于25ml培養(yǎng)瓶，靜置培養(yǎng)。將培養(yǎng)1周的部分細胞胰酶消化

松果體細胞,體外研究,松果體