【摘要】：盡管預(yù)防性乙肝病毒(1aepatitis B virus,HBV)疫苗已經(jīng)在全球廣泛應(yīng)用,慢性持續(xù)性感染仍然是重要的健康問題。目前全世界慢性HBV感染已經(jīng)超過3.6億人,乙肝相關(guān)的肝硬化和肝癌的死亡率正逐年增加。因此,明確:HBV感染的慢性化機(jī)制,設(shè)計(jì)更為有效的治療性疫苗是當(dāng)前刻不容緩的問題。 HBV病毒作為嗜肝的DNA病毒,本身對肝細(xì)胞并沒有損害。MHC—I類分子限制 性的CD8 T細(xì)胞即細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)在清除胞內(nèi)乙肝病 毒和肝細(xì)胞的損傷中均起關(guān)鍵作用。CTL通過對病毒相關(guān)抗原表位的識別、活化,經(jīng) 穿孔素/顆粒酶依賴的途徑殺傷靶細(xì)胞,或通過Fas/FasL 途徑啟動靶細(xì)胞的凋亡;以及通過細(xì)胞因子釋放的非細(xì)胞毒途徑如IFN.Y等抑制病毒的復(fù)制。近年來研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子釋放的非細(xì)胞毒途徑在清除HBV中可能起更為重要的作用,使傳統(tǒng)的細(xì)胞毒途徑占主導(dǎo)地位的學(xué)說受到了挑戰(zhàn)。 現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展尤其是MHC-I類分子限制性表位肽/四聚體復(fù)合物(Tetrameric complex)即tetramer技術(shù)的產(chǎn)生,可以將表位特異性的CTL進(jìn)行精確定量,為我們探 討CTL 與肝損害及控制病毒復(fù)制之間的關(guān)系提供了可能性。 Fetramer技術(shù)結(jié)合胞內(nèi)因子染色和表型分子的檢測,近年來使人們對CTL 的認(rèn)識 迅速達(dá)到單個細(xì)胞水平,并從T細(xì)胞分化的角度對慢性持續(xù)性病毒感染的發(fā)生機(jī)制有 了全新的認(rèn)識。目前T細(xì)胞分化有兩種模式:(1)基于CCR7等歸巢到淋巴組織相關(guān) 受體分子的表達(dá),分中心性記憶細(xì)胞(central memory T cell,’rcM)和效應(yīng)性記憶細(xì)胞(effector memory T cell,TEM)。TcM表達(dá)CCR7,缺乏迅速反應(yīng)的效應(yīng)功能,但能對細(xì)胞因子或病原進(jìn)行快速的反應(yīng)并成熟為TEM,失去CCR7的表達(dá),獲得組織歸巢受體,并大量分泌細(xì)胞因子。 (2)基于共刺激分子CD27和CD28的表達(dá),結(jié)合CD45RA, 將是否表達(dá)CD27、CD28劃分為早期、中期及晚期分化狀態(tài)。表現(xiàn)為初始型 (CD45RA CD27 CD28 )、 記憶型(CD45RA—CD27 CD28 )、 效應(yīng)型(CD45RA ’本項(xiàng)目受國家重點(diǎn)撼礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(973計(jì)劃)一抗原結(jié)構(gòu)特征與免疫應(yīng)答的關(guān)系(No.2001CB510001)、國家自然科學(xué)基金重人項(xiàng)目一基于表位免疫識別結(jié)構(gòu)信息研(No。llllIIlI)的資助。 WP=13 CD27一CD28”)。CD27的早、中期細(xì)胞群具有高增殖能力,低細(xì)胞毒活性;高分化的 CD27“細(xì)胞群具有強(qiáng)有力的效應(yīng)功能,高表達(dá)具有直接殺傷效應(yīng)的穿孔素、Granzymes 等,增殖能力低。細(xì)胞分化表型的認(rèn)識對病毒感染慢性化機(jī)制及疫苗設(shè)計(jì)策略有了全 新的啟示。 新近將T細(xì)胞分化的觀點(diǎn)引入對HIV感染T細(xì)胞表型的研究,發(fā)現(xiàn)免疫控制作用 失敗的原因是CTL效應(yīng)細(xì)胞的分化成熟障礙。無論是表位特異性的CD4 T細(xì)胞還是 CD8 T細(xì)胞,與CMV病毒特異性T細(xì)胞相比,都表現(xiàn)為一種CD27 的“中間分化”的 不成熟狀態(tài),這些延遲分化的表型表現(xiàn)為穿孔素和IFN-v分泌的降低,病毒由此可以 逃避清除而進(jìn)行持續(xù)復(fù)制狀態(tài)。這種現(xiàn)象不僅表現(xiàn)在HIV感染中,還出現(xiàn)在 Epstein-Barr病毒感染及其它病毒感染和腫瘤生長中。由此認(rèn)為,抗原特異性T細(xì)胞的 分化成熟障礙可能是解釋CTL 失控的關(guān)鍵因素。 基于上述研究結(jié)果,我們推測在慢性HBV感染患者體內(nèi),CTL免疫控制能力的 喪失也可能由T細(xì)胞分化成熟障礙造成。為此本研究首先從量的角度對慢性乙肝患者 體內(nèi)表位特異性的CTL進(jìn)行了定量研究,隨后從質(zhì)的角度對表位特異性的CTL 進(jìn)行 了功能檢測,并對這些CTL進(jìn)行了表型分析。 本實(shí)驗(yàn)選取四個在急性感染時具有代表性的優(yōu)勢性表位,即針對HBV核心抗原 core 18—27,被膜抗原enV 183-19l、env 335-343以及聚合酶pol 575-583的PE-tetramer‘ 試劑,結(jié)合PE.-Cy5標(biāo)記的CD8單克隆抗體,采用流式細(xì)胞儀熒光激活細(xì)胞分類術(shù)雙 標(biāo)染色的方法,通過全血法和分離肝浸潤淋巴細(xì)胞的方法對慢性HBV感染患者體內(nèi) CTL進(jìn)行直接離體的準(zhǔn)確定量,結(jié)合肝損害的標(biāo)志轉(zhuǎn)氨酶水平、病毒載量,采用多元 逐步回歸分析(multiple stepwise regression analysis)的方法,從科學(xué)統(tǒng)計(jì)的角度達(dá)到對 不同表位特異性CTL的宏觀斷面分析。 在功能檢測中,本研究首先通過固相化學(xué)合成法合成了core 18—27、env 183—19l、 env 335-343和pol 575.583四個表位肽,選擇了具有代表意義的細(xì)胞毒效應(yīng)分子穿孔 素和細(xì)胞因子IFN-Y。通過PE標(biāo)記的tetramer、PE-Cy5標(biāo)記的CD8單克隆抗體、FITC 標(biāo)記的穿孔素和IFN-Y的單克隆抗體,進(jìn)行流式細(xì)胞儀熒光激活細(xì)胞分類術(shù)三色熒光 標(biāo)記的直接離體分析和體外肽擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。同時選用FITC標(biāo)記的表型標(biāo)志CCR7、CD27 和CD28的單克隆抗體,通過流式細(xì)胞儀三色熒光標(biāo)記的方法進(jìn)行了表型的分析。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),慢性活動性乙肝患者體內(nèi)仍可檢測出多克隆的CTL反應(yīng),肝臟浸潤的 淋巴細(xì)胞中表位特異性的CTL 比外周血的數(shù)量要多。表明在慢性HBV感染體內(nèi),表 位特異性的CTL并未克隆清除。但這些表位特異性的CTI.,與病毒載量和轉(zhuǎn)氨酶水平 WP=14 都沒有顯著相關(guān)性(P0.05)。提示慢性乙肝患者體內(nèi)存在的CTL可能并不直接造成肝 細(xì)胞的損害;表位特異性的CTL數(shù)量并不能代表機(jī)體的保護(hù)性免疫狀態(tài)。 單純從CTL數(shù)量檢測的角度無法解釋體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶水平升高的原因。進(jìn)一步通過效 應(yīng)分子檢測的功能實(shí)驗(yàn),
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392
【圖文】：

圖 1-1：流式細(xì)胞儀分析時目標(biāo)細(xì)胞的設(shè)門左圖 R1 為全血法淋巴細(xì)胞的劃門，右圖 R2 為 CD8high細(xì)胞的劃門Figure 1-1 The gates of aimed cells on the anaysis by FACSscan plots show lymphocytyes obtained from whole blood after red cell lysed (left,RDot plots show CD8highcells obtained from lymphocytyes(right,R2)

圖 1-1：流式細(xì)胞儀分析時目標(biāo)細(xì)胞的設(shè)門左圖 R1 為全血法淋巴細(xì)胞的劃門，右圖 R2 為 CD8high細(xì)胞的劃門Figure 1-1 The gates of aimed cells on the anaysis by FACSscanot plots show lymphocytyes obtained from whole blood after red cell lysed (left,Dot plots show CD8highcells obtained from lymphocytyes(right,R2)

【參考文獻(xiàn)】

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1 李若冰,陳紅松,謝堯,費(fèi)然,叢旭,范春蕾,王松霞,魏來,王宇;慢性乙型肝炎患者外周血樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答[J];中華肝臟病雜志;2003年10期

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本文編號：2717611