【摘要】：絕經(jīng)是卵巢功能衰竭的結果,若女性在40歲之前絕經(jīng)則稱為卵巢功能早衰,在臨床上主要表現(xiàn)為過早絕經(jīng),高促性腺激素、低雌激素血癥。卵巢功能早衰的病因?qū)W至今為止仍不十分清楚,目前已知的原因有：遺傳性、酶缺陷、醫(yī)源性、免疫性以及感染等。卵巢早衰由于病因不明確,所以目前的治療主要是針對性治療為主,其中包括：激素替代治療、輔助生殖技術的不孕癥治療和干細胞的細胞治療技術。干細胞技術為治療卵巢早衰患者提供了前景,不僅可以治愈由于激素下降導致的臨床癥狀,更為廣大不孕患者帶來了福音。但是由于干細胞的研究還沒有處于臨床應用階段,還存在倫理和免疫排斥等技術難題,這些都阻礙了該技術在臨床上的廣泛應用。最新發(fā)展起來的iPS技術將有可能克服胚胎干細胞在這些技術上的障礙,為干細胞的應用拓展出更大的應用前景。 本論文的工作分為兩部分：第一部分采用囊胚內(nèi)細胞團培養(yǎng)的方法建立大鼠胚胎干細胞系,采用iPS技術建立大鼠誘導多能干細胞系,這兩種干細胞系的建立為誘導分化顆粒細胞提供有用的研究材料；第二部分通過大鼠胚胎干細胞、iPS細胞和顆粒細胞分別共培養(yǎng)誘導分化產(chǎn)生類顆粒細胞樣細胞,對挑選出的卵巢早衰相關基因在誘導分化產(chǎn)生的兩種細胞表達情況進行探討。實驗方法和結果如下： 第一部分大鼠胚胎干細胞系的建立及誘導大鼠成體細胞重編程為誘導的多能干細胞 目的：建立大鼠胚胎干細胞系及大鼠iPS細胞系。 方法：通過囊胚內(nèi)細胞團培養(yǎng)法建立大鼠胚胎干細胞系；通過慢病毒載體系統(tǒng)導入6個轉錄因子：OCT4, NANOQ SOX2, LIN28, C-MYC, KLF4,從而建立大鼠iPS細胞系；對建立的胚胎干細胞系和iPS細胞系鑒定其干細胞特性,方法有：堿性磷酸酶活性、SSEA-1表面標志物檢測、Nanog表面標志物檢測、染色體核型分析、畸胎瘤實驗和未分化的細胞特異性基因檢測(Oct4、Sox2、Nanog、Nodal、 Fgf4、Gal、Leftyb、Lin28、Gabra)。 結果： 1.建立了大鼠胚胎干細胞系,該細胞堿性磷酸酶活性為陽性,細胞表面表達干細胞標志物SSEA-1和Nanog,傳代過程中保持正常的大鼠染色體核型、畸胎瘤結果顯示該細胞具有分化為三個胚層細胞的能力、未分化細胞特異性基因(Oct4、Sox2、Nanog、Nodal、Fgf4、 Gal、Leftyb、Lin28、Gabra)在該細胞系中高表達。 2.建立了大鼠iPS細胞系,該細胞堿性磷酸酶活性為陽性,細胞表面表達干細胞標志物SSEA-1和Nanog,傳代過程中保持正常的大鼠染色體核型、畸胎瘤結果顯示該細胞具有分化為三個胚層細胞的能力、未分化細胞特異性基因(Oct4、Sox2、Nanog、Nodal、Fgf4、 Gal、Leftyb、Lin28、Gabra)在該細胞系中高表達。 結論：成功建立了大鼠的胚胎干細胞系和iPS細胞系,為后續(xù)研究提供了很好的研究材料。 第二部分誘導大鼠胚胎干細胞和iPS細胞向顆粒細胞分化 目的：誘導大鼠胚胎干細胞及大鼠iPS細胞分化產(chǎn)生類顆粒細胞,探討分化產(chǎn)生的細胞是否具有顆粒細胞功能。 方法：通過與顆粒細胞共培養(yǎng)方法誘導大鼠胚胎干細胞和大鼠iPS細胞產(chǎn)生類顆粒細胞；雌二醇的測定檢測誘導分化后的細胞分泌雌二醇的功能；熒光免疫方法檢測誘導分化后細胞FSHR受體的表達情況；Real.time PCR方法檢測卵巢早衰相關基因3MP15,FMR1,FSHR, INHA,AMH,NOBOX,FOXO3,EIF2B,FIGLA和GDF9在誘導分化后細胞中的表達情況。 結果： 1.大鼠胚胎干細胞誘導分化后產(chǎn)生的細胞在形態(tài)上和顆粒細胞相似；免疫熒光結果顯示分化后細胞膜表面表達顆粒細胞特異性標志物FSH激素受體；雌二醇檢測顯示誘導分化后細胞具有顆粒細胞的重要功能分泌雌二醇。 2.大鼠iPS細胞誘導分化后產(chǎn)生的細胞在形態(tài)上和顆粒細胞相似；免疫熒光結果顯示分化后細胞膜表面表達顆粒細胞特異性標志物FSH激素受體；雌二醇檢測顯示誘導分化后細胞具有顆粒細胞的重要功能分泌雌二醇。 3.Real.time PCR方法檢測卵巢早衰相關基因BMP15,FMR1, FSHR,INHA,AMH,NOBOX.FOX03,EIF2B,FIGLA和GDF9在誘導分化后細胞中的表達情況顯示:BMP15,INHA,FSHR,AMH,NOBOX,和GDF9基因在誘導分化后的大鼠iPS細胞和大鼠胚胎干細胞中都顯著性高表達；FMRl基因在誘導分化后的大鼠iPS細胞中高表達,而在誘導分化后的大鼠胚胎干細胞中無差異；EIF2B和FOXO3基因在誘導分化后的大鼠iPS細胞中顯著性高表達,而在誘導分化后的大鼠胚胎干細胞中微弱上調(diào)；FIGLA基因在誘導分化后的大鼠iPS細胞中表達下調(diào),而在誘導分化后的大鼠胚胎干細胞中表達上調(diào)。 結論： 1.大鼠胚胎干細胞誘導分化后成功產(chǎn)生了類顆粒細胞,具有顆粒細胞的重要功能。 2.大鼠iPS細胞誘導分化后成功產(chǎn)生了類顆粒細胞,具有顆粒細胞的重要功能。 3.卵巢早衰相關基因3MP15, FMR1, FSHR, INHA, AMH, NOBOX, FOXO3, EIF2B, FIGLA和GDF9中,可能BMP15, INHA, FSHR, AMH, NOBOX,和GDF9基因由于在兩種干細胞分化后檢測表達結果一致,提示這幾個基因可能在卵巢早衰機制中具有更為重要的功能,為進一步研究提供了很好的線索。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【圖文】：

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本文編號：2714367