【摘要】：絕經(jīng)是卵巢功能衰竭的結(jié)果,若女性在40歲之前絕經(jīng)則稱為卵巢功能早衰,在臨床上主要表現(xiàn)為過早絕經(jīng),高促性腺激素、低雌激素血癥。卵巢功能早衰的病因?qū)W至今為止仍不十分清楚,目前已知的原因有：遺傳性、酶缺陷、醫(yī)源性、免疫性以及感染等。卵巢早衰由于病因不明確,所以目前的治療主要是針對性治療為主,其中包括：激素替代治療、輔助生殖技術(shù)的不孕癥治療和干細(xì)胞的細(xì)胞治療技術(shù)。干細(xì)胞技術(shù)為治療卵巢早衰患者提供了前景,不僅可以治愈由于激素下降導(dǎo)致的臨床癥狀,更為廣大不孕患者帶來了福音。但是由于干細(xì)胞的研究還沒有處于臨床應(yīng)用階段,還存在倫理和免疫排斥等技術(shù)難題,這些都阻礙了該技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用。最新發(fā)展起來的iPS技術(shù)將有可能克服胚胎干細(xì)胞在這些技術(shù)上的障礙,為干細(xì)胞的應(yīng)用拓展出更大的應(yīng)用前景。 本論文的工作分為兩部分：第一部分采用囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)的方法建立大鼠胚胎干細(xì)胞系,采用iPS技術(shù)建立大鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系,這兩種干細(xì)胞系的建立為誘導(dǎo)分化顆粒細(xì)胞提供有用的研究材料；第二部分通過大鼠胚胎干細(xì)胞、iPS細(xì)胞和顆粒細(xì)胞分別共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化產(chǎn)生類顆粒細(xì)胞樣細(xì)胞,對挑選出的卵巢早衰相關(guān)基因在誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的兩種細(xì)胞表達(dá)情況進(jìn)行探討。實驗方法和結(jié)果如下： 第一部分大鼠胚胎干細(xì)胞系的建立及誘導(dǎo)大鼠成體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 目的：建立大鼠胚胎干細(xì)胞系及大鼠iPS細(xì)胞系。 方法：通過囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)法建立大鼠胚胎干細(xì)胞系；通過慢病毒載體系統(tǒng)導(dǎo)入6個轉(zhuǎn)錄因子：OCT4, NANOQ SOX2, LIN28, C-MYC, KLF4,從而建立大鼠iPS細(xì)胞系；對建立的胚胎干細(xì)胞系和iPS細(xì)胞系鑒定其干細(xì)胞特性,方法有：堿性磷酸酶活性、SSEA-1表面標(biāo)志物檢測、Nanog表面標(biāo)志物檢測、染色體核型分析、畸胎瘤實驗和未分化的細(xì)胞特異性基因檢測(Oct4、Sox2、Nanog、Nodal、 Fgf4、Gal、Leftyb、Lin28、Gabra)。 結(jié)果： 1.建立了大鼠胚胎干細(xì)胞系,該細(xì)胞堿性磷酸酶活性為陽性,細(xì)胞表面表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物SSEA-1和Nanog,傳代過程中保持正常的大鼠染色體核型、畸胎瘤結(jié)果顯示該細(xì)胞具有分化為三個胚層細(xì)胞的能力、未分化細(xì)胞特異性基因(Oct4、Sox2、Nanog、Nodal、Fgf4、 Gal、Leftyb、Lin28、Gabra)在該細(xì)胞系中高表達(dá)。 2.建立了大鼠iPS細(xì)胞系,該細(xì)胞堿性磷酸酶活性為陽性,細(xì)胞表面表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物SSEA-1和Nanog,傳代過程中保持正常的大鼠染色體核型、畸胎瘤結(jié)果顯示該細(xì)胞具有分化為三個胚層細(xì)胞的能力、未分化細(xì)胞特異性基因(Oct4、Sox2、Nanog、Nodal、Fgf4、 Gal、Leftyb、Lin28、Gabra)在該細(xì)胞系中高表達(dá)。 結(jié)論：成功建立了大鼠的胚胎干細(xì)胞系和iPS細(xì)胞系,為后續(xù)研究提供了很好的研究材料。 第二部分誘導(dǎo)大鼠胚胎干細(xì)胞和iPS細(xì)胞向顆粒細(xì)胞分化 目的：誘導(dǎo)大鼠胚胎干細(xì)胞及大鼠iPS細(xì)胞分化產(chǎn)生類顆粒細(xì)胞,探討分化產(chǎn)生的細(xì)胞是否具有顆粒細(xì)胞功能。 方法：通過與顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)方法誘導(dǎo)大鼠胚胎干細(xì)胞和大鼠iPS細(xì)胞產(chǎn)生類顆粒細(xì)胞；雌二醇的測定檢測誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞分泌雌二醇的功能；熒光免疫方法檢測誘導(dǎo)分化后細(xì)胞FSHR受體的表達(dá)情況；Real.time PCR方法檢測卵巢早衰相關(guān)基因3MP15,FMR1,FSHR, INHA,AMH,NOBOX,FOXO3,EIF2B,FIGLA和GDF9在誘導(dǎo)分化后細(xì)胞中的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.大鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后產(chǎn)生的細(xì)胞在形態(tài)上和顆粒細(xì)胞相似；免疫熒光結(jié)果顯示分化后細(xì)胞膜表面表達(dá)顆粒細(xì)胞特異性標(biāo)志物FSH激素受體；雌二醇檢測顯示誘導(dǎo)分化后細(xì)胞具有顆粒細(xì)胞的重要功能分泌雌二醇。 2.大鼠iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化后產(chǎn)生的細(xì)胞在形態(tài)上和顆粒細(xì)胞相似；免疫熒光結(jié)果顯示分化后細(xì)胞膜表面表達(dá)顆粒細(xì)胞特異性標(biāo)志物FSH激素受體；雌二醇檢測顯示誘導(dǎo)分化后細(xì)胞具有顆粒細(xì)胞的重要功能分泌雌二醇。 3.Real.time PCR方法檢測卵巢早衰相關(guān)基因BMP15,FMR1, FSHR,INHA,AMH,NOBOX.FOX03,EIF2B,FIGLA和GDF9在誘導(dǎo)分化后細(xì)胞中的表達(dá)情況顯示:BMP15,INHA,FSHR,AMH,NOBOX,和GDF9基因在誘導(dǎo)分化后的大鼠iPS細(xì)胞和大鼠胚胎干細(xì)胞中都顯著性高表達(dá)；FMRl基因在誘導(dǎo)分化后的大鼠iPS細(xì)胞中高表達(dá),而在誘導(dǎo)分化后的大鼠胚胎干細(xì)胞中無差異；EIF2B和FOXO3基因在誘導(dǎo)分化后的大鼠iPS細(xì)胞中顯著性高表達(dá),而在誘導(dǎo)分化后的大鼠胚胎干細(xì)胞中微弱上調(diào)；FIGLA基因在誘導(dǎo)分化后的大鼠iPS細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),而在誘導(dǎo)分化后的大鼠胚胎干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論： 1.大鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后成功產(chǎn)生了類顆粒細(xì)胞,具有顆粒細(xì)胞的重要功能。 2.大鼠iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化后成功產(chǎn)生了類顆粒細(xì)胞,具有顆粒細(xì)胞的重要功能。 3.卵巢早衰相關(guān)基因3MP15, FMR1, FSHR, INHA, AMH, NOBOX, FOXO3, EIF2B, FIGLA和GDF9中,可能BMP15, INHA, FSHR, AMH, NOBOX,和GDF9基因由于在兩種干細(xì)胞分化后檢測表達(dá)結(jié)果一致,提示這幾個基因可能在卵巢早衰機制中具有更為重要的功能,為進(jìn)一步研究提供了很好的線索。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【圖文】：

博士學(xué)位論文 第一部分在物鏡20倍放大情況下觀察大鼠胚胎干細(xì)胞的克�。▓D1A)，大鼠胚胎干細(xì)胞克隆在形態(tài)上更趨向于類似小鼠胚胎干細(xì)胞。該克隆表面光滑，邊緣明顯，細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密。而非干細(xì)胞樣的克隆細(xì)胞松散，沒有明顯的邊界，表面粗糖。并且大鼠胚胎干細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶（圖1B)，以及干細(xì)胞marker SSEA-1免疫染色陽性即紅色的膜染色（圖1F)，干細(xì)胞特異marker Nanog表達(dá)陽性即紅色的核染色（圖ID)。3.2大鼠胚胎干細(xì)胞的染色體核型分析

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本文編號：2714367