【摘要】：第一部分Hedgehog信號通路在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中的動態(tài)表達(dá) [背景與目的]肝纖維化是各種原因引起的持續(xù)性肝損傷共有的病理階段,其特點(diǎn)為大量纖維增生并伴有纖維降解的相對或絕對不足,細(xì)胞外基質(zhì)沉積,最終可進(jìn)展演變?yōu)楦斡不８卫w維化的形成是一個由多種細(xì)胞介導(dǎo),多種細(xì)胞因子共同參與的復(fù)雜病理過程。最新的研究顯示Hedgehog (Hh)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。本實驗旨在研究Hh信號通路在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中肝纖維化不同階段的表達(dá)情況。 [方法]7到8周雄性C57BL/6J小鼠32只,隨機(jī)分為正常對照組(n=12),肝纖維化模型組(n=12),及肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)組(n=8)。腹腔注射0.8ml/kg的CCl4,每周兩次,復(fù)制肝纖維化模型。自發(fā)逆轉(zhuǎn)組于第4周末停用CCl4并正常飼養(yǎng)2周,建立肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型。分別于第3周、第6周收集各組小鼠肝臟、血清標(biāo)本。HE染色及Masson染色評估造模不同時期小鼠的肝纖維化病變程度。比較各組小鼠肝臟生化指標(biāo)及羥脯氨酸(Hyp)含量。免疫組化、免疫印跡和實時定量PCR法分析各組小鼠肝組織Hh通路的配體Shh,核轉(zhuǎn)錄因子Gli1, Gli2,及α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)情況。 [結(jié)果]CCl4腹腔注射3周后,肝纖維化模型組小鼠肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞變性壞死,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,中央靜脈周圍及匯管區(qū)纖維沉積增多。CCl4腹腔注射6周后,肝纖維化模型組小鼠肝臟的以上病變程度較第3周加重。自發(fā)逆轉(zhuǎn)組小鼠在停用CCl4兩周后,肝細(xì)胞變性壞死減少,中央靜脈周圍及匯管區(qū)纖維組織減少。造模第3周、第6周時,肝纖維化模型組小鼠的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST),總膽紅素(TBil)及Hyp均明顯高于正常對照組小鼠(P0.01),其中造模6周時的ALT、TBil、Hyp顯著高于造模3周時(P0.05)。自發(fā)逆轉(zhuǎn)組小鼠ALT、AST、TBil及Hyp水平與造模6周的肝纖維化模型組小鼠相比均顯著下降,與造模3周的肝纖維化模型組小鼠相近。免疫組化顯示,相比正常對照組,造模3周、6周的肝纖維化模型組小鼠肝臟Shh,Gli1,Gli2,α-SMA的表達(dá)均明顯增高,且Shh與α-SMA陽染細(xì)胞的分布位置相似,均為匯管區(qū)、纖維間隔及增生的膽管周圍,而Glil與Gli2陽性染色的分布位置相似,均為匯管區(qū),小葉間靜脈周圍。自發(fā)逆轉(zhuǎn)組小鼠肝臟Shh, Gli1, Gli2, α-SMA陽性染色的細(xì)胞數(shù)目較造模6周的肝纖維化模型組減少,接近于造模3周時水平,甚至更少。免疫印跡和實時定量PCR顯示,造模3周、6周的肝纖維化模型組小鼠肝臟Shh, Gli1, Gli2, α-SMA在mRNA及蛋白水平表達(dá)均顯著高于正常小鼠,自發(fā)逆轉(zhuǎn)組小鼠肝臟Shh, Gli1, Gli2, α-SMA在mRNA及蛋白水平表達(dá)較造模6周的肝纖維化模型組顯著減少。 [結(jié)論]雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射0.8ml/kg的CCl4,每周兩次,可成功復(fù)制肝纖維化模型。造模6周對比造模3周,小鼠肝纖維化程度更重。造模4周后撤去CCl4注射,小鼠肝纖維化可發(fā)生自動逆轉(zhuǎn),恢復(fù)至造模3周時水平,甚至程度更輕。Hh信號通路在正常小鼠肝組織中處于抑制狀態(tài),在肝纖維化模型中被異常激活,且隨著肝纖維化的進(jìn)展,Hh信號通路活化程度增加,隨著肝纖維化的自動逆轉(zhuǎn),活化程度減輕。Hh信號通路的異常激活可能對肝纖維化的發(fā)生發(fā)展起重要作用。 第二部分環(huán)巴胺及姜黃在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中的預(yù)防和治療作用 [背景與目的]環(huán)巴胺是Hedgehog (Hh)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異性抑制劑,目前的研究顯示,抑制Hh信號通路的異常活化可能有助于改善肝纖維化。姜黃有抗炎、抗氧化和抗纖維化活性,動物實驗的結(jié)果提示姜黃可預(yù)防肝纖維化,但對于已經(jīng)形成明顯纖維化的肝組織是否有保護(hù)作用尚有爭議。本實驗旨在研究環(huán)巴胺及姜黃是否可以減輕CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型小鼠的肝纖維化程度,并研究其治療機(jī)制是否為通過抑制Hh信號通路的活化所致。 [方法]7到8周雄性C57BL/6J小鼠72只,隨機(jī)分為正常對照組(n=12),肝纖維化模型組(n=12),低劑量環(huán)巴胺預(yù)防組(n=8),高劑量環(huán)巴胺預(yù)防組(n=8),姜黃預(yù)防組(n=8),低劑量環(huán)巴胺治療組(n=8),高劑量環(huán)巴胺治療組(n=8)及姜黃治療組(n=8)。腹腔注射0.8ml/kg的CCl4,每周兩次,復(fù)制肝纖維化模型。低劑量環(huán)巴胺預(yù)防組、高劑量環(huán)巴胺預(yù)防組及姜黃預(yù)防組在開始注射CCl4的同時,分別給以環(huán)巴胺5mg/kg/d,環(huán)巴胺10mg/kg/d腹腔注射,姜黃400mg/kg/d灌胃治療3周。低劑量環(huán)巴胺治療組、高劑量環(huán)巴胺治療組及姜黃治療組在CCl4造模3周后,在繼續(xù)造模的同時,開始分別給以環(huán)巴胺5mg/kg/d,環(huán)巴胺10mg/kg/d腹腔注射,姜黃400mg/kg/d灌胃治療3周。分別于第3周、第6周收集各組小鼠肝臟、血清標(biāo)本。比較正常對照組、肝纖維化模型組和各藥物干預(yù)組之間肝臟生化、羥脯氨酸(Hyp)水平和肝臟病理組織學(xué)改變。通過免疫組化、免疫印跡和實時定量PCR法分析各組小鼠肝組織Hh通路的配體Shh,核轉(zhuǎn)錄因子Gli1, Gli2,及α平滑肌肌動蛋白(a-SMA)的表達(dá)情況。 [結(jié)果]相比同期肝纖維化模型組,低劑量環(huán)巴胺預(yù)防組,高劑量環(huán)巴胺預(yù)防組,姜黃預(yù)防組小鼠肝臟生化、肝組織Hyp含量及組織學(xué)表現(xiàn)均明顯改善。免疫組化顯示,預(yù)防性給予環(huán)巴胺5mg/kg/d,環(huán)巴胺10mg/kg/d或姜黃400mg/kg/d均明顯減少肝纖維化模型小鼠肝組織中Shh, Gli1, Gli2,及a-SMA陽染細(xì)胞的數(shù)目。免疫印跡和實時定量PCR顯示,預(yù)防性給予環(huán)巴胺5mg/kg/d,環(huán)巴胺10mg/kg/d或姜黃400mg/kg/d均明顯減少肝纖維化模型小鼠肝組織中Shh, Gli1, Gli2,及a-SMA mRNA表達(dá),降低Gli1, a-SMA蛋白水平的表達(dá)。相比同期肝纖維化模型組,低劑量環(huán)巴胺治療組,高劑量環(huán)巴胺治療組,姜黃治療組小鼠肝臟生化、肝組織Hyp含量及組織學(xué)改變均未見明顯改善。免疫組化顯示,比造模延遲3周給予環(huán)巴胺5mg/kg/d,環(huán)巴胺10mg/kg/d或姜黃400mg/kg/d均不能減少肝纖維化模型小鼠肝組織中Shh, Gli1, Gli2,及a-SMA陽染細(xì)胞的數(shù)目。免疫印跡和實時定量PCR顯示,延遲給予環(huán)巴胺5mg/kg/d,環(huán)巴胺10mg/kg/d或姜黃400mg/kg/d均不能顯著減少肝纖維化模型小鼠肝組織中Shh, Gli1, Gli2,及a-SMA mRNA水平的表達(dá),或降低Gli1, a-SMA蛋白水平的表達(dá)。 [結(jié)論]環(huán)巴胺及姜黃可以預(yù)防和改善CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟纖維化,其作用機(jī)制與抑制Hh通路的異常激活有關(guān),可能成為治療肝纖維化的新藥物。延遲給予環(huán)巴胺及姜黃均不能顯著改善小鼠肝纖維化,因此對于用藥時機(jī)的選擇,仍需要進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R575.2

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本文編號：2714611