【摘要】：衰老是一種隨著年齡增長、組織細胞老化、器官功能下降引起的不可避免的生理過程。1977年Besedovsky提出了神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)理論，而下丘腦—垂體—性腺軸（HPG軸）是其中重要的組成部分。隨著機體衰老性腺功能逐漸降低，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對HPG軸的調(diào)節(jié)功能也發(fā)生了改變，整個HPG軸機能減退。D-半乳糖致衰老模型是大家公認、也是在衰老及延緩衰老的研究中應(yīng)用比較多的衰老模型之一。本研究旨在觀察D-半乳糖衰老模型HPG軸的衰老變化，完善D-半乳糖致衰老的機理研究；另外觀察中藥天年飲（Tiannianyin，TNY）延緩衰老的作用機制,為進一步研究中藥抗衰老的作用機理奠定理論和實驗基礎(chǔ)。 一、性腺軸系的衰老變化 （一）目的 觀察D-半乳糖衰老模型下丘腦—垂體—睪丸軸的衰老變化。 （二）方法 選用成年雄性SD大鼠80只（由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供）。 將80只大鼠隨機分為兩組：①正常組：24只，正常SD大鼠，不作任何處理；②模型組：56只，制備亞急性衰老大鼠模型。待模型制備成功后，分別用于觀察衰老變化及TNY延緩衰老的研究。 1.衰老模型的建立：D-半乳糖用生理鹽水配制成25%的溶液，按200mg/kg/d腹腔注射，連續(xù)40天。在造模的過程中每周測體重一次，同時觀察大鼠毛色、行為等外觀特征的變化情況及進行相應(yīng)指標的檢測，以確定模型制作是否成功。 2.大鼠經(jīng)內(nèi)眥取血，離心后取上清，分別檢測：①采用RT-200C雷杜半自動生化分析儀檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和高密度脂蛋白（HDL-C）的含量；②采用黃嘌呤氧化酶法檢測血清SOD的活性；③采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測血清睪酮含量。 3.大鼠斷頭取腦，取下丘腦，采用高效液相色譜法（HPLC）以 WP=5 SHIMADZU-10A高效液相色譜儀（日本島津）和L-ECD-6A電化學(xué)檢測器（日本島津）檢測下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素（NA）、多巴胺（DA）、5-羥色胺（5-HT）的含量。 4.大鼠經(jīng)4%多聚甲醛+2.5%戊二醛灌注固定后，分別取下丘腦弓狀核、腺垂體、睪丸，超薄切片，透射電鏡下觀察它們超微結(jié)構(gòu)的變化。 5.大鼠經(jīng)4%多聚甲醛灌注固定，取雙側(cè)睪丸，常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚5-7μm。HE染色觀察睪丸生精小管形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化；SP免疫組化法檢測睪丸生精細胞PCNA、端粒酶表達的變化情況；TUNEL法檢測生精細胞的凋亡情況；原位雜交方法檢測p53mRNA的表達情況。 6.大鼠斷頭處死，取雙側(cè)睪丸，Western印跡分析方法檢測大鼠睪丸p53蛋白的表達情況。 （三）結(jié)果 大鼠經(jīng)D-半乳糖連續(xù)腹腔注射后，下丘腦—垂體—性腺軸及相關(guān)生化指標發(fā)生了一系列衰老變化。 1.大鼠體重與外觀特征的變化 模型大鼠體重增加比例低于正常大鼠；毛色逐漸發(fā)黃，無光澤，并且出現(xiàn)掉毛的情況；精神狀態(tài)較正常大鼠明顯萎靡，活動減少。 2.血脂 模型大鼠血清TC、TG含量明顯升高（與正常大鼠比較分別為P0.01，P0.05），HDL-C含量明顯下降（與正常大鼠比較P0.05）。 3.血清SOD活性 D-半乳糖注射后，血清SOD活性由327.69±34.45NU/ml降至184.15±43.99 NU/ml，明顯降低（P0.05）。 4.血清睪酮含量 正常大鼠血清睪酮含量為1.26±0.73 ng/ml；D-半乳糖模型大鼠血清睪酮含量為0.52±0.26ng/ml，與正常大鼠相比明顯降低（P0.01）。 5.下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量 模型大鼠下丘腦NA、DA、5-HT的含量分別為681.30±80.32 ng/g、201.11±49.78 ng/g、513.09±66.52 ng/g，與正常大鼠的含量978.32±69.78 ng/g、342.11±58.77 ng/g、898.64±68.70 ng/g相比顯著下降（P0.05）。 WP=6 6.下丘腦、垂體、睪丸超微結(jié)構(gòu) ⑴下丘腦弓狀核：大鼠弓狀核由暗神經(jīng)元、亮神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、毛細血管及神經(jīng)氈組成，D-半乳糖可使弓狀核內(nèi)的暗神經(jīng)元、亮神經(jīng)元、神經(jīng)氈等結(jié)構(gòu)發(fā)生衰老變化。模型大鼠暗神經(jīng)元線粒體、溶酶體增多，線粒體嵴斷裂、空泡化；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒、并形成髓樣小體；高爾基體擴張。亮神經(jīng)元可見核不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)脂褐素聚集，線粒體嵴斷裂，高爾基體明顯擴張。另外，，弓狀核內(nèi)的神經(jīng)氈和突觸也出現(xiàn)異常變化。 ⑵垂體：模型大鼠垂體促性腺激素細胞超微結(jié)構(gòu)明顯改變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張，高爾基體增多、擴張，線粒體嵴斷裂、空泡化，并觀察到脫粒細胞。 ⑶睪丸：模型大鼠睪丸部分基膜增厚，生精細胞排列紊亂，多數(shù)細胞器變性。支持細胞胞質(zhì)內(nèi)溶酶體增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生、擴張，線粒體空泡樣變性。精原細胞可見胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多空泡。另外還可見細胞膜內(nèi)陷包裹線粒體或溶酶體等結(jié)構(gòu)形成的凋亡小體。 ⒎睪丸生精細胞增殖、調(diào)亡及相關(guān)因素的分析 模型大鼠睪丸光鏡下觀察可見生精小管部分基膜增厚、不完整，生精小管內(nèi)生殖細胞減少，排列稀疏。生精細胞增殖、調(diào)亡及相關(guān)因素分析結(jié)果如下： ⑴PCNA：免疫陽性細胞主要包括精原細胞和初級精母細胞，部分支持細胞和肌樣細胞核也可見著色；免疫陽性產(chǎn)物位于細胞核，通常為棕黃色顆粒。PCNA陽性細胞率模型組與正常組相比明顯降低（P0.01）。 ⑵凋亡：各組大鼠睪丸生精細胞均有凋亡發(fā)生，凋亡細胞位于生精小管近基底部，在模型大鼠凋亡細胞成簇存在，區(qū)別于正常大鼠凋亡細胞單個散在。凋亡細胞包括精原細胞和
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R33;R285

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本文編號：2710331