【摘要】：1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)是一種存在于血漿中的具有生物活性的神經(jīng)鞘磷脂。S1P主要由血小板合成和分泌,其他細胞如紅細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞、肥大細胞以及內(nèi)皮細胞都能夠分泌S1P。S1P在細胞內(nèi)可作為第二信使,與調(diào)節(jié)性分子如酶、通道蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等相互作用而發(fā)揮效應(yīng);S1P還可以作為細胞外配體,與幾乎存在于所有細胞種類的S1P膜受體結(jié)合,并通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,影響細胞的生存、增殖、分化、遷移、血管生成等,發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。S1P受體為G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors, GPCR),目前至少發(fā)現(xiàn)有5種,分別為S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5,分布于不同的細胞。內(nèi)皮細胞主要表達S1PR1、S1PR2和S1PR3。不同亞型的S1P受體結(jié)合的G蛋白不盡相同,其中S1PR1與Gi相偶聯(lián),S1PR2/3則與Gi、Gq、G12/13偶聯(lián)。另外,S1PR1和S1PR2/3對S1P的親和力也有區(qū)別,生理濃度下(0.5～1 μmol/L) S1P主要與S1PR1結(jié)合;濃度較高則與S1PR2/3結(jié)合。有研究發(fā)現(xiàn),生理濃度下S1P與S1PR1結(jié)合,介導(dǎo)Racl依賴的內(nèi)皮屏障保護作用;濃度較高時,則與S1PR2/3結(jié)合,介導(dǎo)RhoA依賴的內(nèi)皮屏障損傷作用。本課題組前期研究結(jié)果顯示,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)誘導(dǎo)皮膚微血管內(nèi)皮細胞(human dermal microvascular endothelial cells, HMVECs)炎性反應(yīng)過程中,S1PR2的表達增加,內(nèi)皮單層細胞通透性增高,S1PR2的特異性拮抗劑JTE-013可以明顯降低TNF-α引起的內(nèi)皮單層細胞高通透性。此研究結(jié)果與Sanchez T等人的一致,他們發(fā)現(xiàn),在臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),S1PR2的表達增多導(dǎo)致內(nèi)皮單層細胞的通透性升高,內(nèi)皮屏障功能降低,JTE-013可以明顯抑制H202引起的肺高通透性及肺水腫。以上結(jié)果均提示S1PR2的表達增加參與介導(dǎo)了內(nèi)皮屏障功能障礙。本研究也發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導(dǎo)HUVECs炎性反應(yīng)過程中,S1PR2的蛋白表達水平升高。那么炎性刺激下S1PR2表達增多的機制是什么?調(diào)控S1PR2的表達是否會調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的屏障功能進而影響炎癥反應(yīng)的進程呢?本文旨在探討影響S1PR2表達的上游調(diào)控因素,以較全面了解S1PR2在內(nèi)皮細胞的表達調(diào)節(jié)。肝X受體(liverXreceptors,LXRs)是孤核受體家族成員,充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子的角色。LXRs有兩種亞型:LXRα和LXRβ。LXRα的表達具有組織特異性,它在肝臟表達最高,在肝臟、腎上腺、腸、脂肪、巨噬細胞、肺和腎較低表達,而LXRβ幾乎在所有組織中都有表達。Li Z等人發(fā)現(xiàn)LXRα/β在肝內(nèi)皮細胞和枯否細胞高表達。SpillmannF等人發(fā)現(xiàn)LXR-α、LXR-β和RXR-α在臍靜脈內(nèi)皮細胞中有表達。LXRα和LXRβ兩個亞型具有相同的激活配體。內(nèi)源性配體主要為膽固醇在體內(nèi)代謝的衍生物氧化甾醇;外源性人工合成激動劑有T0901317、GW3965等。LXR被內(nèi)源性配體或人工合成激動劑激活后,需與視黃醇類X受體(retinoid X receptor,RXR)結(jié)合形成異二聚體(LXR/RXR),方具有轉(zhuǎn)錄因子活性。RXR包括α、β、γ三種亞型,該受體通過形成同源二聚體或與其它核受體形成異二聚體,參與細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。RXR的天然配體是9-順式視黃酸(9-cis RA)。LXR的配體和RXR的配體均可以激活LXR/RXR異二聚體,該異二聚體通過與靶基因的LXR反應(yīng)元件(LXR response element,LXRE)的特定核苷酸序列結(jié)合,上調(diào)相關(guān)基因的表達。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體 A1 (ATP-binding cassette transporterA1,ABCA1)是大家公認的 LXR/RXR 的靶基因,當(dāng)LXR和(或)RXR被激活時,LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性將增強,進而會增加ABCA1mRNA的表達,因此本研究通過檢測ABCA1mRNA水平來反映LXR激動劑或RXR激動劑對HUVECsLXR/RXR轉(zhuǎn)錄活性的影響。研究顯示LXR激動劑T0901317具有抗動脈粥樣硬化作用,一方面它能夠上調(diào)脂代謝關(guān)鍵基因(如ABCA1)的表達,進而調(diào)節(jié)膽固醇分解、儲存、吸收和轉(zhuǎn)運,從而維持脂質(zhì)的動態(tài)平衡,抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展;另一方面,近年來研究顯示,它能夠抑制一些經(jīng)典的炎癥性基因(如iNOS、COX-2、IL-6、IL-1β、單核細胞趨化蛋白1 (MCP-1)、單核細胞趨化蛋白3 (MCP-3)和非金屬蛋白酶等)的表達,通過抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用,抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。但是目前關(guān)于LXRs抗炎機制的研究多集中在巨噬細胞、單核細胞等免疫細胞及基因敲除動物,疾病動物模型等,而在血管內(nèi)皮細胞罕有報道。本研究擬以血管內(nèi)皮細胞為靶細胞,研究LXR/RXR是否能夠通過調(diào)節(jié)S1PR2的表達,影響內(nèi)皮屏障功能,進而控制炎癥反應(yīng)的進程。通過這項研究,我們希望為臨床上炎癥性疾病的治療找到新的靶點。基因表達的調(diào)控有多種方式,其中就包括微小RNA (microRNA,miRNA)對基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNAs是一類長約21～23個核苷酸非編碼RNA。miRNA通過與靶信使RNA (messenger RNA,mRNA)的 3' 端非編碼區(qū)(3,-untranslated region,3 -UTR)序列非完全互補配對結(jié)合,抑制靶mRNA的翻譯和/或降解靶mRNA。研究顯示miRNA的表達異常與癌癥、心血管疾病與糖尿病等疾病均密切相關(guān),必將在疾病的診斷與治療上扮演重要的角色。S1PR2的表達是否接受miRNA調(diào)節(jié),關(guān)鍵在于S1PR2的3'-UTR有沒有miRNA的潛在結(jié)合位點。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測,人S1PR2的3'-UTR (全長約2.4kb)中含有多種miRNA的潛在結(jié)合位點,它們分別是miR-130/301、miR-19、miR-96/1271 和 miR-182, miR-24-3p 等,提示 S1PR2 的基因表達可能受miRNAs的調(diào)節(jié)。本研究還將從miRNA的角度出發(fā),分析S1PR2表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。目的:本研究以臍靜脈內(nèi)皮細胞為靶點,研究轉(zhuǎn)錄因子LXR/RXR是否能夠通過調(diào)節(jié)S1PR2的表達進而影響內(nèi)皮細胞的通透性。本研究還將從miRNA的角度進一步探討LXR/RXR調(diào)節(jié)S1PR2表達的具體機制,通過這項研究,我們希望為臨床上炎癥性疾病的治療找到新的靶點。方法:本研究以HUVECs為研究對象,采用western blot技術(shù)檢測S1PR2、LXR-α、RXR-α等蛋白表達水平的變化;采用跨細胞電阻儀檢測內(nèi)皮單層細胞跨膜電(trans-endothelial electric resistance,TEER),以反映內(nèi)皮單層細胞通透性;采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測microRNA及ABCA1mRNA水平的變化;ABCA1mRNA水平的變化被用來反映LXR激動劑或RXR激動劑對HUVECs LXR/RXR轉(zhuǎn)錄活性的的影響;采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶的活性以反映轉(zhuǎn)錄因子RXR-α與S1PR2啟動子片段的結(jié)合能力及miR-130a-3p與S1PR2的3'-UTR的結(jié)合能力。本研究所有數(shù)值均用平均值±標(biāo)準差表示。使用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,統(tǒng)計方法采用單因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)或獨立樣本 t 檢驗(Independent-samples t Test)進行分析,方差不齊時則采用Dunnet's T3方法。以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1. TNF-α使內(nèi)皮細胞S1PR2的表達增加本課題組前期研究結(jié)果及他人研究結(jié)果均提示內(nèi)皮細胞S1PR2的表達增加參與介導(dǎo)了內(nèi)皮屏障功能障礙。為了驗證HUVECs炎性反應(yīng)過程中S1PR2的表達是否增多,本實驗用細胞因子TNF-α (100 ng/ml)刺激細胞不同時間(1,3, 6,12,24 h),western blot檢測S1PR2的表達。結(jié)果顯示,TNF-α分別刺激不同時間后,各組S1PR2蛋白的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.407, P=0.000)。TNF-α刺激12 h時可觀察到S1PR2蛋白表達水平升高(P=0.005),刺激24 h時S1PR2表達仍維持在較高水平(P=0.000),提示S1PR2在HUVECs炎性反應(yīng)過程中確實也起著非常重要的作用。那么炎性刺激下S1PR2的表達為什么會發(fā)生這樣的改變,控制S1PR2的表達是否會通過影響內(nèi)皮細胞的通透性,進而影響炎性反應(yīng)的進程呢?本研究接下來將主要探討S1PR2在內(nèi)皮細胞的表達調(diào)節(jié)。2. TNF-α通過LXR/RXR實現(xiàn)對S1PR2的表達調(diào)節(jié)(1)生物信息學(xué)軟件初步預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子LXR/RXR可能調(diào)控S1PR2基因的表達生物信息學(xué)軟件預(yù)測到RXR-α在S1PR2基因啟動子區(qū)有結(jié)合位點,提示LXR/RXR可能通過RXR-α與S1PR2啟動子區(qū)結(jié)合并發(fā)揮調(diào)控作用。我們假設(shè):在靜息的HUVECs,LXR/RXR對S1PR2的表達有抑制作用。TNF-α誘導(dǎo)HUVECs炎癥反應(yīng)過程中,LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性降低,從而在一定程度上解除了其對S1PR2表達的抑制,導(dǎo)致S1PR2表達增多,從而減弱內(nèi)皮細胞的屏障功能。接下來我們將對此進行驗證。(2)TNF-α可通過減少LXR-α的表達從而抑制LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性為了研究TNF-α對LXR-α表達的影響。本研究用TNF-α ( 100 ng/ml)刺激HUVECs不同時間,采用western blot技術(shù)檢測細胞中LXR-α的表達水平,結(jié)果顯示TNF-α分別刺激不同時間后,各組LXR-α的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.449,P=0.05)。TNF-α作用24 h能夠顯著減少LXR-α的表達(P=0.015),而且在觀察時間內(nèi)TNF-α的抑制作用具有時間依賴性。提示TNF-α能夠減少LXR-α的表達。當(dāng)LXR-α表達減少時,LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性也會受到抑制,則必然會降低其靶基因ABCA1 mRNA水平。用TNF-α (100 ng/ml)刺激HUVECs不同時間,采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測HUVECs中ABCAlmRNA的表達水平,結(jié)果顯示TNF-α分別刺激不同時間后,各組ABCAlmRNA的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=429.092, P=0.000)。TNF-α 作用于 HUVECs 3 h 即可抑制 ABCA1mRNA 的表達(P=0.000),作用6 h時抑制效果更加顯著(P=0.000),作用12 h, 24 h時仍能維持顯著的抑制效果(P=0.000)。提示TNF-α確實能夠通過減少LXR-α的表達,抑制LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性,從而降低ABCA1mRNA水平。那么前期結(jié)果中我們觀察到的TNF-α使內(nèi)皮細胞S1PR2的表達增加是否與此相關(guān)呢?(3) LXR/RXR活性的變化可影響S1PR2蛋白的表達①激活LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性可抑制S1PR2蛋白的表達因為為了確定LXR、RXR激動劑是否能夠激活HUVECs LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性,本研究用 LXR 激動劑 T0901317 (20μmol/L)和 GW3965 (2μmol/L)及RXR激動劑9-cis RA (1 μmol/L)分別作用于HUVECs不同時間(6、12、14h),采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測HUVECs中ABCA1 mRNA的表達水平,結(jié)果顯示各激動劑組ABCA1mRNA的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為205.582、2230.686、470.416; P值均為0.000)。三種激動劑作用6 h (P值均為 0.000),12 h (P值均為 0.000), 24 h (P 值均為 0.000)均上調(diào) ABCA1 mRNA表達水平。提示LXR、RXR激動劑均能夠激活LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性,LXR和RXR在HUVECs中均具有生物學(xué)功能。為了探討LXR/RXR被激活后對S1PR2蛋白表達的影響,本實驗分別觀察了 T0901317、GW3965、9-cisRA影響S1PR2蛋白表達的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)。用不同濃度的LXR激動劑T0901317 ( 2、5、10、20 μmol/L )作用于HUVECs 24 h,用western blot技術(shù)檢測S1PR2蛋白的表達。結(jié)果顯示T0901317不同劑量組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.432, P=0.003)。20μmol/LT0901317能夠抑制S1PR2蛋白的表達(P=0.001)。用20μmol/LT0901317作用于HUVECs不同時間(12、15、18、21、24 h),結(jié)果顯示T0901317不同時間組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.062, P=0.000)。20 μmol/L T0901317 作用 15 h 即可抑制 S1PR2蛋白的表達(P=0.008),作用18h、21h、24h均表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)(P值均為0.000)。而且在所觀察的24 h內(nèi),T0901317的抑制效應(yīng)呈時間依賴性。用不同濃度LXR另一激動劑GW9365 (0.5、1、2μmol/L)作用于HUVECs 24 h,用western blot技術(shù)檢測S1PR2蛋白的表達。結(jié)果顯示GW9365不同劑量組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.011,P=0.000)。0.5、1、2 μmol/L GW9365均能夠抑制S1PR2的表達(P值分別為0.025、0.000、0000),而且GW9365的抑制作用呈劑量依賴性。用2 μmol/L GW9365作用于HUVECs不同時間(12、18、24 h),結(jié)果顯示GW9365不同時間組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.198,P=0.016)。GW9365作用18 h即可抑制S1PR2蛋白的表達(P=0.045),24 h時抑制效果更加顯著(P=0.004),而且在所觀察的24h內(nèi),其抑制作用具有時間依賴性。用不同濃度的RXR激動劑9-cisRA (0.1、1、2、5、10 μμmol/L)作用于HUVECs 24 h,用western blot技術(shù)檢測S1PR2蛋白的表達。結(jié)果顯示9-cis RA不同劑量組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.003, P=0.003)。0.1 μmol/L 9-cisRA即能夠抑制S1PR2蛋白的表達(P=0.002),1、2、5μmol/L9-cisRA均表現(xiàn)出抑制效應(yīng)(P值分別為0.002、0.008、0.007、0.008),而10μnol/L9-cisRA抑制效果更加顯著(P=0.000)。用1μmol/L9-cisRA作用于HUVECs不同時間(6、12、18、24 h),結(jié)果顯示9-cis RA不同時間組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.535,P=0.034)。9-cis RA作用12 h、18 h可觀察到抑制作用(P分別為0.018、0.016),但作用24 h時其抑制作用解除,這可能跟RXR及LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。以上結(jié)果提示,LXR、RXR激動劑分別激活LXR/RXR后均可抑制S1PR2的表達。②siRNA下調(diào)LXR或RXR的表達可增加S1PR2蛋白的表達實驗分別用 60 nmol/L 的 LXR-α siRNA 或 20 nmol/L 的 RXR-α siRNA 及其相應(yīng)負對照轉(zhuǎn)染HUVECs 60 h,用western blot技術(shù)檢測LXR-α、RXR-α及S1PR2蛋白的表達。結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染對照組相比,轉(zhuǎn)染組細胞LXR-α和RXR-α的表達分別被抑制(t值分別為7.367、3.370; P值分別為0.000、0.015), S1PR2的蛋白表達均增多(t值分別為-4.145、-3.120; P值分別為0.014、0.045)。提示小分子RNA干擾LXR-α或RXR-α表達后均上調(diào)S1PR2的表達。綜上所述,激活LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性可抑制S1PR2的表達,而小分子RNA干擾LXR-α和RXR-α的表達均可上調(diào)S1PR2的表達,提示LXR/RXR能夠調(diào)控S1PR2的表達。3.LXR/RXR的活性變化對內(nèi)皮屏障功能的影響研究表明S1P濃度較高時與S1PR2結(jié)合,介導(dǎo)RhoA依賴的屏障損傷作用。本課題組前期研究已證明給予過量的S1P (10 μmol/L)引起內(nèi)皮屏障功能的損傷,通透性升高。本研究也已經(jīng)證實LXR/RXR的激活可下調(diào)S1PR2的表達。本研究主要觀察LXR/RXR的激活是否可減輕S1PR2介導(dǎo)的過量S1P引起的內(nèi)皮細胞屏障功能的損傷。實驗中先分別給予細胞 T0901317 (20 μmol/L)、GW3965 (2 μmol/L)、9-cisRA (1μmol/L)刺激,18h后換液,再給予S1P (10μmol/L)刺激,然后用電阻檢測儀檢測 S1P 刺激 0min,5min,10min,20min,30min,40min,50 min, 60 min時的跨內(nèi)皮細胞電阻(TEER)。結(jié)果顯示:空白對照組、S1P刺激40min組與T0901317組TEER差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.232,P=0.006)。S1P刺激40 min 可引起TEER降低(P=0.004),而預(yù)先給予T0901317可顯著抑制TEER的降低(P=0.007)�？瞻讓φ战M、S1P刺激50min組與GW365組TEER差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.980, P=0.004)。S1P刺激50min可引起TEER降低(P=0.002),預(yù)先給予GW3965 可顯著抑制TEER的降低(P=0.006)。空白對照組、S1P刺激30 min組與9-cis RA組TEER差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.662,P=0.032)。S1P 刺激 30 min 可引起 TEER 降低(P=0.016),預(yù)先給予9-cisRA可顯著抑制TEER的降低(P=0.043),以上結(jié)果提示LXR/RXR的激活通過抑制S1PR2的表達能夠減輕過量S1P引起的內(nèi)皮單層細胞高通透性,保護內(nèi)皮屏障功能。4.LXR/RXR通過miR-130α-3p實現(xiàn)對S1PR2的表達調(diào)節(jié)(1)觀察轉(zhuǎn)錄因子LXR/RXR能否通過RXR-α和S1PR2基因的啟動子區(qū)發(fā)生相互作用生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示,S1PR2啟動子區(qū)(轉(zhuǎn)錄起始點上游2KbP)沒有LXR-α、LXR-β的結(jié)合位點,但有RXR-α的結(jié)合位點。我們假設(shè)LXR/RXR可能通過RXR-α與S1PR2基因啟動子區(qū)結(jié)合從而發(fā)揮直接的的調(diào)控作用。對此我們通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)進行了驗證。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)錄因子RXR-α對含S1RP2啟動子片段(轉(zhuǎn)錄起始點上游2KbP)的基因表達水平無直接調(diào)控作用。因此我們考慮LXR/RXR可能通過其它途徑調(diào)節(jié)S1PR2的表達。為了更加全面了解其調(diào)控機理,本研究從miRNA的角度進一·步探討LXR/RXR調(diào)控S1PR2表達的機制。(2)篩選既能夠靶向調(diào)控S1PR2的表達,又能被LXR/RXR調(diào)控的miRNAs通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析,我們初步篩選到miR-130a-3p和miR-24-3p可能既被LXR/RXR調(diào)控又能夠靶向調(diào)控S1PR2的表達。前期實驗結(jié)果已證實,TNF-α能夠抑制LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性,LXR/RXR能夠調(diào)控S1PR2的表達。再根據(jù)microRNA的作用特點,我們假設(shè),靜息的HUVECs能表達一定量的miR-130a-3p和miR-24-3p,對S1PR2的表達有抑制作用,而這些特定的miRNA可能也同時接受LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,在TNF-α誘導(dǎo)HUVECs炎癥反應(yīng)過程中,LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性降低,使得這些miRNA的表達減少,從而在一定程度上解除了對靶基因S1PR2表達的抑制,導(dǎo)致S1PR2表達增多,從而減弱內(nèi)皮細胞的屏障功能。接下來我們將對此進行驗證。(3)激活LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性可上調(diào)miR-130a-3p的表達由前文可知,RXR激動劑9-cisRA在較低濃度時就可以激活LXR/RXR。因此本實驗選用9-cis RA來激活LXR/RXR,確定LXR/RXR的激活能否上調(diào)miR-130a-3p和miR-24-3p的表達。實驗中用9-cis RA (1 μol/L)作用于細胞不同時間(1、3、6、12、24h),實時熒光定量PCR技術(shù)觀察miR-130a-3p和miR-24-3p表達的變化。結(jié)果顯示9-cis RA作用不同時間后,各組miR-130a-3p的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.111,P=0.050)。與對照組相比,9-cis RA作用于細胞1 h(P=0.012)、3h (P=0.003)、6h (P=0.034)、12h (P=0.016)、24h (P=0.038)均上調(diào)miR-130a-3p的表達。9-cisRA作用不同時間后,各組miR-24-3p的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.545, P=0.086)。提示當(dāng)用RXR激動劑激活LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性時,可上調(diào)miR-130a-3p的表達,但不能上調(diào)miR-24-3p的表達。(4) TNF-α既可以降低LXR/RXR的活性,同時也降低miR-130a-3p的表達本研究前期結(jié)果已證實TNF-α能夠抑制LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性。再結(jié)合前文的假設(shè),我們推測TNF-α誘導(dǎo)HUVECs炎性反應(yīng)過程中,LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性降低將導(dǎo)致miR-24-3p及miR-130a-3p的表達減少。本研究對此進行了驗證。把 TNF-α (100 ng/ml)作用于 HUVECs 不同時間(1、3、6、12、24 h),運用實時熒光定量PCR技術(shù)觀察其對miR-130a-3p及miR-24-3p表達的影響。結(jié)果顯示TNF-α作用細胞不同時間后,各組miR-130a-3p的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=44.464, P=0.000)。與對照組相比,TNF-α 作用細胞 3 h (P=0.003)、6 h(P=0.000)、12h (P=0.000)、24h (P=0.000)時均可抑制 miR-130a-3p 的表達。TNF-α作用細胞不同時間后,各組miR-24-3p的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.242,P=0.001)。與對照組相比,TNF-α作用細胞1 h (P=0.001)、3 h (P=0.015)時可觀察到miR-24-3p的表達顯著增多,然后逐漸恢復(fù)。提示TNF-α刺激確能導(dǎo)致miR-130α-3p表達的減少,但對miR-24-3p沒有此作用�；赥NF-α對LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性的影響和生物信息學(xué)預(yù)測,更提示炎性反應(yīng)過程中,LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性降低可能導(dǎo)致了 miR-130a-3p表達的下降。以上結(jié)果顯示激活LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性可上調(diào)miR-130a-3p的表達,但不能上調(diào)miR-24-3p的表達;LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性降低可能導(dǎo)致miR-130a-3p表達的下降,但不能導(dǎo)致miR-24-3p表達的減少。提示LXR/RXR可調(diào)節(jié)miR-130a-3p的表達,但不能調(diào)控miR-24-3p的表達。因此在后續(xù)實驗中我們選擇miR-130a-3p作為我們的研究對象。5.過表達或抑制表達miR-130a-3p可影響S1PR2的蛋白表達①過表達miR-130a-3p可抑制S1PR2的蛋白表達將人工化學(xué)合成的miRNA的模擬物(miRNAmimics) (100 nmol/L)及陰性對照(mimics negative control,mimics NC) (100 nmol/L)轉(zhuǎn)染至內(nèi)皮細胞,24 h時實時熒光定量PCR技術(shù)檢測到miR-130a-3P (t=-5660.830, P=0.000)的表達增多,提示轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染48 h時Western blot技術(shù)檢測到S1PR2蛋白表達水平下降較陰性對照組有統(tǒng)計學(xué)差異(t=4.191,P=0.014)。提示過表達miR-130a-3P可抑制S1PR2的蛋白表達。②抑制miR-130a-3p的表達可上調(diào)S1PR2的蛋白表達將人工化學(xué)合成的miRNA的抑制物(miRNA inhibitor) (200 nmol/L)及陰性對照(inhibitor negative control,inhibitorNC) (200 nmol/L)轉(zhuǎn)染至內(nèi)皮細胞,24h時實時熒光定量PCR技術(shù)檢測到miR-130a-3p (t=17.964, P=0.002)的表達減少,提示轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染48h時western blot技術(shù)檢測到S1PR2蛋白表達水平上調(diào)較陰性對照組有統(tǒng)計學(xué)差異(t=-4.053, P=0.015)。提示抑制miR-130a-3p的表達可上調(diào)S1PR2的蛋白表達。綜上所述,miR-130a-3p能夠調(diào)控S1PR2的蛋白表達。③miR-130a-3p可直接與S1PR2的3'UTR結(jié)合并發(fā)揮抑制作用接下來我們還通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步確定miR-130a-3p與S1PR2是否具有直接的相互作用關(guān)系。結(jié)果顯示miR-130a-3p對含S1PR2 3'UTR的基因表達水平有抑制作用(t=2.911,P=0.027),抑制率約為21.52%。提示miR-130a-3P能夠直接抑制S1PR2的蛋白表達。結(jié)論:1.TNF-α使內(nèi)皮細胞S1PR2的表達增加;2.TNF-α通過LXR/RXR實現(xiàn)對S1PR2的表達調(diào)節(jié);3.激活LXR/RXR的轉(zhuǎn)錄活性能夠改善內(nèi)皮屏障功能障礙;4.LXR/RXR通過miR-130a-3p實現(xiàn)對S1PR2的表達調(diào)節(jié);5.miR-130a-3p能夠直接抑制S1PR2的表達。綜上所述:靜息的臍靜脈內(nèi)皮細胞能夠表達一定量的miR-130a-3p,對S1PR2的表達起抑制作用。在TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)過程中,LXR/RXR轉(zhuǎn)錄活性的降低,引起miR-130a-3p表達減少,在一定程度上解除了 miR-130a-3p對S1PR2的表達抑制,最終導(dǎo)致S1PR2的表達增加,內(nèi)皮屏障功能減弱。
【圖文】：

蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｆ＝８．４０７，尸＝０．０００）。ＴＮＦ－ａ刺激１２ｈ時可觀察到逡逑Ｓ１ＰＲ２蛋白表達水平升高（尸＝０．００５），刺激２４邋ｈ時Ｓ１ＰＲ２的表達仍維持在較高逡逑水平（Ｐ＝０．０００）（見圖４），提示Ｓ１ＰＲ２在ＨＵＶＥＣｓ炎性反應(yīng)過程中確實也起著逡逑非常重要的作用。逡逑那么炎性刺激下Ｓ１ＰＲ２的表達增多的機制是什么？調(diào)控Ｓ１ＰＲ２的表達是否逡逑會調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的屏障功能進而影響炎癥反應(yīng)的進程呢？本文旨在探討影響逡逑Ｓ１ＰＲ２表達的上游調(diào)控因素，以較全面了解Ｓ１ＰＲ２在內(nèi)皮細胞的表達調(diào)節(jié)。逡逑２５逡逑

一、ＴＮＦ－ａ通過ＬＸＲ／ＲＸＲ實現(xiàn)對Ｓ１ＰＲ２的表達調(diào)節(jié)逡逑基因表達的調(diào)節(jié)方式很多，過程復(fù)雜，包括轉(zhuǎn)錄前的調(diào)節(jié)，，如表觀遺傳學(xué)逡逑的調(diào)節(jié)等；轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，如轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)等；轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)，如逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ的調(diào)節(jié)等；翻譯水平的調(diào)節(jié)等等，本研究首先從轉(zhuǎn)錄因子的角度研究逡逑Ｓ１ＰＲ２表達的調(diào)節(jié)。逡逑１．生物信息學(xué)軟件初步預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子ＬＸＲ／ＲＸＲ可能調(diào)控Ｓ１ＰＲ２基因的逡逑表達逡逑由前文可知，ＬＸＲ能夠抑制炎性基因的表達，ＬＸＲ必須與ＲＸＲ形成逡逑ＬＸＲ／ＲＸＲ才具有轉(zhuǎn)錄因子活性。生物信息學(xué)軟件預(yù)測到ＲＸＲ－ａ在Ｓ１ＰＲ２基因逡逑啟動子區(qū)有結(jié)合位點（見圖５），提示ＬＸＲ／ＲＸＲ可能通過ＲＸＲ－ａ與Ｓ１ＰＲ２啟逡逑動子區(qū)結(jié)合并發(fā)揮調(diào)控作用。我們假設(shè)：在靜息的ＨＵＶＥＣｓ，ＬＸＲ／ＲＸＲ對Ｓ１ＰＲ２逡逑的表達有抑制作用。ＴＮＦ－ａ誘導(dǎo)ＨＵＶＥＣｓ炎癥反應(yīng)過程中，ＬＸＲ／ＲＸＲ的轉(zhuǎn)錄逡逑活性降低，從而在一定程度上解除了其對Ｓ１ＰＲ２表達的抑制，導(dǎo)致Ｓ１ＰＲ２表達逡逑增多，從而減弱內(nèi)皮細胞的屏障功能。接下來我們將對此進行驗證。逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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3 王雪梅;康衛(wèi)華;杜麗珍;曹紀萍;劉鐵鋼;;超聲評價動脈硬化兔血管內(nèi)皮舒張功能的實驗研究[J];中國藥物與臨床;2007年02期

本文編號：2709970