發(fā)布時(shí)間：2020-06-12 01:55

【摘要】：單核及巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，通過分泌多種細(xì)胞因子等調(diào)節(jié)對(duì)入侵病原體的反應(yīng)，但是過強(qiáng)的反應(yīng)，尤其是嚴(yán)重創(chuàng)傷及大手術(shù)后等，機(jī)體的免疫機(jī)能下降的情況下，可出現(xiàn)膿毒癥(Sepsis)、膿毒性休克。高達(dá)50％的膿毒癥病人是由革蘭陰性菌感染所致，脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，即內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的主要致病成分；極微量?jī)?nèi)毒素即可使機(jī)體首先通過天然免疫系統(tǒng)對(duì)其做出反應(yīng)。機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)LPS的識(shí)別機(jī)制極為復(fù)雜，1990年發(fā)現(xiàn)的CD14是LPS的識(shí)別受體，但由于CD14分子沒有跨膜部分，自身不能將信號(hào)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，還需要其它膜結(jié)合分子協(xié)同作用。TLR4及MD-2蛋白的發(fā)現(xiàn)是對(duì)LPS受體識(shí)別機(jī)制研究的突破性進(jìn)展，MD-2與TLR4的胞外區(qū)相偶聯(lián)，因其是一個(gè)只含有160個(gè)氨其酸的分泌蛋白，具有分子量小，核酸片段短，且為可分泌型等特點(diǎn)，對(duì)MD-2的調(diào)控更易于操作，因而成為治療內(nèi)毒素休克十分有潛力的靶點(diǎn)之一。研究其在內(nèi)毒素跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及其與TLR4、CD14之間的關(guān)系，是確定對(duì)MD-2進(jìn)行調(diào)控有無深遠(yuǎn)意義的基礎(chǔ)。 LPS對(duì)人外周血單核巨噬細(xì)胞的活化有賴于其受體基因的表達(dá)譜，雖然有一些對(duì)CD14，TLR4基因表達(dá)受LPS調(diào)節(jié)的報(bào)道，但報(bào)道的結(jié)果并不一致，且很少有對(duì)MD-2基因受LPS調(diào)節(jié)的報(bào)道；更沒有同時(shí)報(bào)道MD-2／TLR4／CD14基因在同一標(biāo)本內(nèi)受LPS調(diào)節(jié)的研究。核糖核酸酶保護(hù)法是一種可同時(shí)在同一標(biāo)本內(nèi)檢測(cè)多種基因表達(dá)的先進(jìn)方法，且其重復(fù)性、客觀性都較強(qiáng)，但是需要構(gòu)建相關(guān)基因的檢測(cè)模板組，因而本研究率先構(gòu)建了該檢測(cè)模板組，并成功地應(yīng)用于檢測(cè)人外周血單核細(xì)胞上關(guān)注的三種基因的表達(dá)。為進(jìn)一步明確MD-2在單核細(xì)胞LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，可以通過增強(qiáng)或抑制其功能的方式，檢測(cè)細(xì)胞LPS信號(hào)功能的變化，從而反映其作用，并為確定可否做為調(diào)控靶點(diǎn)提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。通過基因轉(zhuǎn)染的方法將MD-2或其功能突變體導(dǎo)入受體細(xì)胞，可使細(xì)胞增強(qiáng)表達(dá)MD-2或阻抑MD-2的功能。因而，我們首先根據(jù)相關(guān)報(bào)道，成功地構(gòu)建了MD-2的功能失活表達(dá)載體，而后將正常功能的MD-2表達(dá)載體及新構(gòu)建的功能突變體導(dǎo)入人單核細(xì)胞株THP1內(nèi)，觀察對(duì)LPS效應(yīng)的影響。為 第三軍醫(yī)大學(xué)博士研究生論文 明確MD一2所起的作用的機(jī)制及其與TLR4及CD14之間的關(guān)系，通過觀察它們與LPS 的結(jié)合能力及不同組合的轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)LPS的不同反應(yīng)能力，以探討MD一2發(fā)揮其作用 的可能機(jī)制。 因此擬從以下三部分進(jìn)行研究:1.分離提取人外周血單核細(xì)胞，以LPS刺激，核 糖核酸酶保護(hù)法檢測(cè)MD一2、TLR4、CD14 mRNA表達(dá)變化的規(guī)律。2.構(gòu)建MD一2功 能突變體，將正常功能的MD一2及其功能失活突變體轉(zhuǎn)染進(jìn)單核細(xì)胞株THPI內(nèi)，以 LPS刺激后，觀察細(xì)胞活化功能的變化，以此反映MD一2在LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中所起的作 用。3.將以上三種基因表達(dá)質(zhì)粒以不同組合轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，而后應(yīng)用LPS刺激 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察細(xì)胞NF一kB被活化的改變，及熒光素標(biāo)記的LPS與轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)合能 力，以此來探討MD一2發(fā)揮其作用的可能機(jī)制。 主要結(jié)果及結(jié)論如下: 一、成功地構(gòu)建了用于核糖核酸酶保護(hù)法的模板組:為在基因水平檢測(cè) MD一2/TLR4/C D14表達(dá)變化奠定了基礎(chǔ)。核糖核酸酶保護(hù)法具有靈敏度高，穩(wěn)定性及 重復(fù)性好等特點(diǎn)，因而構(gòu)建了該模板組，并成功地用于檢測(cè)人外周血單核細(xì)胞上述三 種基因的表達(dá)。 二、人外周血單核細(xì)胞上述三種基因的表達(dá)規(guī)律:人外周血單個(gè)核細(xì)胞在受到LPS 刺激后，TLR4，MD一2，CD14 mRNA在刺激后15min一30min即可以明顯增加，在1一3h 則有一過性降低，之后恢復(fù)。檢測(cè)結(jié)果提示:細(xì)胞作為對(duì)LPS的反應(yīng)，迅即增強(qiáng)相關(guān) 受體基因的表達(dá)，但作為機(jī)體自我保護(hù)的一種反應(yīng)，為避免過強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，能反饋 性的適當(dāng)抑制和調(diào)節(jié)LPS受體基因的表達(dá)。另外，因三者的表達(dá)豐度存在明顯的差異， 由于缺乏更多的證據(jù)，，我們只能推測(cè)表達(dá)最低的MD一2可能在LPS信號(hào)中具有更為特 異的作用。 三、構(gòu)建了MD一2功能突變體:根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在人MD一2蛋白分子的第95 位氨基酸，在由半膚氨酸突變?yōu)槔野彼岷蠊δ苁Щ�。我們�?yīng)用 PCR定點(diǎn)突變的方法成 功地構(gòu)建了該突變體。 四、MD一2可調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)能力:轉(zhuǎn)染正常功能的MD一2表達(dá)載體后， THPI細(xì)胞NF一沼活性及細(xì)胞上清內(nèi)TNF一a分泌增強(qiáng)。相反，轉(zhuǎn)染MD一2的功能突變 體后，LPS對(duì)THPI細(xì)胞激活效應(yīng)明顯減弱，表現(xiàn)為NF一沼活性及TNF一a分泌明顯降 低。進(jìn)一步提示，MD一2在LPS對(duì)單核細(xì)胞的激活效應(yīng)中具有重要的地位，而且有望 成為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的靶點(diǎn)之一。 五、MD一2可明顯增強(qiáng)細(xì)胞經(jīng)TLR4對(duì)LPS的結(jié)合能力:單獨(dú)或以各種不同的組 合方式將三種受體基因轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞內(nèi)，以FITC一LPS與細(xì)胞共同孵育，應(yīng)用 第三軍醫(yī)大學(xué)博士研究生論文 流式細(xì)胞儀的方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MD一2可以直接與LPS結(jié)合，雖然這種結(jié)合能力較 低，但是卻可以明顯促進(jìn)LPS與TLR4及CD14的結(jié)合。 六、在LPS對(duì)細(xì)胞NF一kB的活化過程中，需要MD一2/TLR4/CD14三種分子的共 同參與。雖然MD一2可明顯促進(jìn)TLR4與LPS的結(jié)合，且TLR4/MD一2共同轉(zhuǎn)染后細(xì) 胞對(duì)LPS有較強(qiáng)的結(jié)合能力，但是與三種基因共
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2708828