【摘要】：載脂蛋白E（Apolipoprotein E,APOE表示其基因，apoE表示其編碼蛋白）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的載脂蛋白，主要由星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生。近年來，APOE基因多態(tài)性在腦損傷后繼發(fā)性病理生理改變以及傷后轉(zhuǎn)歸中的作用越來越被更多的國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注，普遍認為攜帶APOEε4等位基因的患者腦損傷易損性增加，并且可導(dǎo)致不良預(yù)后，但是相關(guān)機制目前仍不甚明了。 缺氧是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞損傷最常見的原因，是腦創(chuàng)傷、缺血性卒中等疾病的基本病理過程。研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞缺氧后釋放的多種細胞毒性介質(zhì)對周圍神經(jīng)元可產(chǎn)生明顯的損傷。越來越多的研究表明，星形膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)和功能的改變在諸多疾病，如腦水腫、炎性脫髓鞘疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等發(fā)病機制中扮演了重要的角色。星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細胞。然而目前對神經(jīng)保護的研究主要集中于對神經(jīng)元的保護，對其他非神經(jīng)元細胞如星形膠質(zhì)細胞的保護研究卻少見報道。本課題以星形膠質(zhì)細胞為研究對象，模擬腦損傷后腦組織缺血缺氧這一病理生理改變，探討了apoE在此過程中的作用。本課題主要包括以下四方面的研究： 一、星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)及缺氧損傷模型的建立 采用酶消化法原代培養(yǎng)APOE基因敲除（APOE KO）鼠、APOE基因野生（APOE WT）鼠的星形膠質(zhì)細胞、并純化鑒定；參照相關(guān)文獻，予細胞缺氧6h，構(gòu)建星形膠質(zhì)細胞缺氧損傷模型，透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)變化。結(jié)果：光鏡顯示，細胞呈“鋪路石”樣排列，胞體較大呈不規(guī)則形，細胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)，細胞能被抗GFAP的抗體識別；缺氧6h后，通過電鏡均觀察到細胞足突腫脹，線粒體形態(tài)不規(guī)則，空泡化，嵴不規(guī)則，可見細胞核凝集，染色質(zhì)固縮、以及凋亡小體等凋亡細胞明顯特征。結(jié)論：本部分實驗成功構(gòu)建了細胞的缺氧損傷模型，，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。 二、 apoE對星形膠質(zhì)細胞缺氧性損傷的保護作用及機制研究 1.將培養(yǎng)成熟的APOE KO及APOE WT星形膠質(zhì)細胞均分為常氧組、缺氧組、常氧+T0901317組、缺氧+T0901317組，后兩組細胞均為在常氧/缺氧前48h，向細胞培養(yǎng)基中加入促進apoE蛋白表達增加的肝X受體（liver X receptor，LXR）激動劑T0901317,并使其在培養(yǎng)基中的濃度為300nM。流式細胞儀分別檢測以上各組細胞凋亡率情況。2.將培養(yǎng)成熟的APOE KO星形膠質(zhì)細胞按照向其培養(yǎng)基中加入外源性apoE3的濃度分成6組：空白組、100nM組、300nM組、1000nM組、2000nM組、3000nM組，apoE3于缺氧前30min加入，予各組細胞缺氧6h后，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率情況。3.將培養(yǎng)成熟的APOEKO及APOE WT星形膠質(zhì)細胞均分為常氧組、缺氧組、常氧+T0901317組、缺氧+T0901317組，后兩組細胞均為在常氧/缺氧前48h，向細胞培養(yǎng)基中T0901317,并使其在培養(yǎng)基中的濃度為300nM。缺氧6h后，收集各組細胞的細胞外液，通過氨基酸自動分析儀檢測各組細胞外液中谷氨酸的水平。4.將培養(yǎng)成熟的APOE KO星形膠質(zhì)細胞分為常氧組、缺氧組、缺氧+apoE3組、缺氧+MK801組、缺氧+apoE3+MK801組，后3組在缺氧前30min分別向培養(yǎng)基中加入人重組apoE3（1μM）、NMDA受體拮抗劑MK801（10μM）、apoE3（1μM）+MK801（10μM），流式細胞儀分別檢測以上各組細胞凋亡率。5.將培養(yǎng)成熟的APOE KO及APOE WT星形膠質(zhì)細胞均分為對照組、谷氨酸組、對照+T0901317組、谷氨酸+T0901317組，谷氨酸組為向培養(yǎng)基中加入谷氨酸（50mM），對照組即不作任何處理，保持原培養(yǎng)條件不變，后兩組為在未加入/加入谷氨酸前48h，向培養(yǎng)基中加入LXR激動劑T0901317（300nM）；以上各組予繼續(xù)培養(yǎng)24h；流式細胞儀分別檢測以上各組細胞凋亡率。結(jié)果：1.缺氧6h后，APOE KO缺氧組細胞凋亡率明顯高于APOE WT缺氧組(p0.05)；T0901317能明顯降低APOE WT缺氧組細胞凋亡率(p0.05)，但是對APOE KO缺氧組無明顯作用（p＞0.05）。2.從300nM組開始，細胞凋亡率較空白組明顯降低(p0.05)，1000nM組細胞凋亡率最低。3.缺氧后6h，APOE KO組、APOE WT組細胞外液中谷氨酸濃度較常氧組明顯增加(p0.05)，且APOE KO缺氧組明顯高于APOEWT缺氧組(p0.05)；T0901317能明顯降低APOE WT缺氧組細胞外液中谷氨酸濃度(p0.05)，但是對APOE KO缺氧組無明顯作用（p＞0.05）。4.與常氧組相比，缺氧組、缺氧+apoE3組、缺氧+MK801組、缺氧+apoE3+MK801組細胞凋亡率均明顯增加(p0.05)，外源性加入apoE3或（和）MK801后，細胞凋亡率較單純?nèi)毖踅M明顯降低(p0.05)，但是apoE3、MK801對細胞缺氧性損傷的保護作用相似，且兩者作用不疊加。5.谷氨酸處理24h后，APOE KO組、APOE WT組細胞凋亡率較對照組明顯增加(p0.05)，且APOE KO缺氧組明顯高于APOE WT缺氧組(p0.05)；T0901317能明顯降低APOE WT谷氨酸組細胞凋亡率(p0.05)，但是對APOE KO谷氨酸組無明顯作用（p＞0.05）。結(jié)論：apoE對星形膠質(zhì)細胞缺氧性損傷具有保護作用，且這種保護作用具有劑量-反應(yīng)關(guān)系。apoE可抑制星形膠質(zhì)細胞缺氧后NMDA受體的過度激活，降低谷氨酸的毒性，增加星形膠質(zhì)細胞apoE的表達可能是缺氧性神經(jīng)損傷保護的一種新途徑。 三、 apoE在星形膠質(zhì)細胞缺氧性損傷中的表達變化及其機制 將培養(yǎng)成熟的APOE WT鼠的星形膠質(zhì)細胞分為常氧組、缺氧組和干預(yù)組（缺氧+ERK抑制劑），分別予缺氧組和干預(yù)組缺氧6h，干預(yù)組在缺氧之前向培養(yǎng)基中加入ERK信號通路抑制劑U0126， Westernblot法分別檢測檢測三組細胞apoE蛋白表達變化情況。結(jié)果：與常氧組和干預(yù)組相比，缺氧組星形膠質(zhì)細胞表達的apoE蛋白明顯增加(p0.05)。結(jié)論：缺氧使星形膠質(zhì)細胞apoE蛋白水平表達上調(diào)，ERK信號通路參與了該調(diào)節(jié)過程。 四、 APOE基因多態(tài)性在星形膠質(zhì)細胞缺氧性損傷過程中的作用 1.原代培養(yǎng)APOE WT鼠、APOE轉(zhuǎn)基因鼠（ε3、ε4）的星形膠質(zhì)細胞，純化鑒定，并構(gòu)建6h細胞缺氧損傷模型；2.采用流式細胞儀分別檢測各組細胞凋亡率及線粒體膜電位變化情況。結(jié)果：APOEε4組細胞早期凋亡率、線粒體膜電位下降程度明顯高于APOEε3、APOE野生鼠組(p0.05)。結(jié)論：缺氧損傷后早期，與APOEε3、APOE野生鼠組相比，APOEε4組星形膠質(zhì)細胞線粒體膜電位下降程度更大，這可能導(dǎo)致更多的星形膠質(zhì)細胞凋亡。
【圖文】：

對培養(yǎng)成熟純化的星形膠質(zhì)細胞進行倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察：細胞外觀扁積較大，貼壁細胞呈典型的“鋪路石” 樣排列（圖 1A）；GFAP 免疫熒光染色質(zhì)中明顯的膠質(zhì)絲，胞核空染呈空泡狀（圖 1B）。通過對每一觀察視野內(nèi) G色陽性細胞占總細胞數(shù)的比例統(tǒng)計，星形膠質(zhì)細胞純度幾可達 100%。

圖 2 星形膠質(zhì)細胞缺氧 6h 后超微結(jié)構(gòu)變化。A：正常細胞；B:缺氧 6h 后胞質(zhì)中腫脹線粒體（箭頭示）；C：缺氧 6h 后可見凋亡小體。（標尺：1μm）Fig. 2 Ultrastructure of astrocytes exposed to hypoxia for 6h. (A) Control cells; (B) Swollenmitochondria were observed in the cytoplasm (arrowhead); (C) Apoptotic bodies were found in 6hischemic astrocytes. Scale bar = 1μm.4 討論1846 年，Rudolf Virchow 首次描述并命名神經(jīng)膠質(zhì)細胞(neuroglia)，他認為其作用類似于結(jié)締組織,可將神經(jīng)成份粘合在一起,因此命名為神經(jīng)膠質(zhì)。經(jīng)過一個半世紀的研究，目前人們對膠質(zhì)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能有了更為深刻的認識,不僅認為膠質(zhì)細胞具有為神經(jīng)元提供營養(yǎng)與支持作用,而且它在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、突觸傳遞、神經(jīng)組織修復(fù)與再生、神經(jīng)免疫及多種神經(jīng)疾病的病理機制等方面,都起著十
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3411

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 周靜;ApoE在小鼠脊髓損傷修復(fù)過程中的表達變化及其對星型膠質(zhì)細胞的作用研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2017年

2 張娜;高糖缺氧通過增加UCP2表達和線粒體凋亡途徑加重星形膠質(zhì)細胞損傷[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2016年

本文編號：2708240