【摘要】： 衰老(Senescence)是指在細(xì)胞、組織水平的生理機(jī)能的進(jìn)行性丟失，是眾多不同的生理刺激激發(fā)細(xì)胞出現(xiàn)的一種最終的共同狀態(tài)。大量實(shí)驗(yàn)證明信號(hào)通路與衰老的起始和持續(xù)密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以用于研究體外復(fù)制衰老的人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞WI-38細(xì)胞為模型，探討細(xì)胞復(fù)制衰老過程中JAK／STAT信號(hào)通路的主要成員Stat3活性的變化、MMPs／TIMPs系統(tǒng)的變化、AngⅡ的作用及AngⅡ調(diào)控下游基因表達(dá)的有關(guān)信號(hào)通路，揭示衰老發(fā)生的機(jī)制。 第一部分實(shí)驗(yàn)采用Western blotting、間接免疫熒光和EMSA等方法。結(jié)果顯示：AngⅡ通過其AT_1受體誘導(dǎo)WI-38細(xì)胞Stat3、Stat1的磷酸化，形成以磷酸化的Stat3同源二聚體SIF-A為主的復(fù)合物轉(zhuǎn)位入核；AngⅡ以量效、時(shí)效的方式誘導(dǎo)SIF-DNA的結(jié)合，10~(-7)M或10~(-6)M的AngⅡ刺激細(xì)胞60min能夠最大強(qiáng)度的誘導(dǎo)SIF-DNA的結(jié)合，說明AngⅡ能夠活化WI-38細(xì)胞中JAK／STAT信號(hào)通路。 第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞在復(fù)制衰老過程中，，Stat3的活性組成型或生長因子刺激后都有改變。應(yīng)用Northern blotting檢測(cè)了年輕細(xì)胞和衰老細(xì)胞中Stat3 mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞中Stat3 mRNA的表達(dá)與年輕細(xì)胞比無明顯的差別，而Western blotting示衰老細(xì)胞中Stat3蛋白的 第四軍醫(yī)大學(xué)博士研究生論文 表達(dá)明顯高于年輕細(xì)胞，其活性形式磷酸化的Stat3中Stat3）的表達(dá)也不 低于年輕細(xì)胞；Aug 11刺激細(xì)胞后，無論年輕細(xì)胞還是衰老細(xì)胞，Aug 11 都能以同樣強(qiáng)度誘導(dǎo)胞漿中Stat3的磷酸化，但在衰老細(xì)胞核中，無論是 組成型的或Aug 11刺激后的，pstat3蛋白水平都明顯低于年輕細(xì)胞，提示 衰老細(xì)胞中pstat3轉(zhuǎn)位入核受阻；在衰老細(xì)胞中，Aug 11同樣以量效、時(shí) 效的方式，通過其AT；受體誘導(dǎo)Sff－DNA結(jié)合，10”’M的Aug 11刺激衰老細(xì) 胞45－60min能夠最大強(qiáng)度的誘導(dǎo)Sff－DNA的結(jié)合。由前兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果可 推測(cè)出細(xì)胞復(fù)制衰老過程中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子與基因組DNA結(jié)合活性所發(fā) 生的變化，可能影響下游基因的表達(dá)。 第三部分實(shí)驗(yàn)的明膠酶譜結(jié)果顯示：WI－3 8細(xì)胞主要分泌 MMP－2， 且年輕細(xì)胞中的MMP－2活性明顯強(qiáng)于衰老細(xì)胞，年輕細(xì)胞和衰老細(xì)胞中 ＊＊P9的活性均較弱，兩者之間無明顯差別：An gll刺激細(xì)胞48h時(shí)， 年輕細(xì)胞和衰老細(xì)胞中MMP－二的活性稍有增加，兩者之間無差別，而 Aug 11對(duì) MMP一的活性無明顯影響。衰老細(xì)胞中組成型的 TIMP上的表 達(dá)明顯高于年輕細(xì)胞，且 Aug 11可明顯上調(diào)衰老細(xì)胞 TIMPq的表達(dá)，在 Aug 11刺檄衰老細(xì)胞 6h時(shí)，TWl蛋白的表達(dá)己開始上調(diào)，12h達(dá)峰值， 48h時(shí)降至基礎(chǔ)水平。考慮到TIMP刁啟動(dòng)子區(qū)含有S丁結(jié)合位點(diǎn)，Aug 11有可能通過STAT通路調(diào)控TM－l的表達(dá)，為此進(jìn)行了細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)， 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Stat3反義質(zhì)粒、Stat3顯性負(fù)調(diào)突變體質(zhì)粒及Stat3反義寡 核苦酸的衰老細(xì)胞，用 Aug 11刺激后，上調(diào)的 TIMP＊的表達(dá)明顯受抑， 說明 Aug 11通過 STAT通路上調(diào)衰老細(xì)胞 TIMP刁的表達(dá)。由此可以想象 在衰老細(xì)胞中TIMP－l等的組成型表達(dá)或生長因子誘導(dǎo)表達(dá)增加，可通過 抑制MMP－9的活性來促進(jìn)維持正常狀態(tài)，形成衰老特異的生理、形態(tài)的 變化。在細(xì)胞衰老過程中，M：MPs／TIMPS比率的下降，通過抑制永生細(xì) 胞的出現(xiàn)，在避兔腫瘤的形成中起著主要的作用。推測(cè)下調(diào)TIMP－l等表 4 達(dá)的細(xì)胞因子或生長因子可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。相反，上調(diào)TIMP－1表 達(dá)的可能與衰老或硬化有關(guān)。 總之，細(xì)胞復(fù)制衰老過程中Stat3活性下降，不是衰老細(xì)胞Stat3磷 酸化的減少，而是活化的 Stat3核轉(zhuǎn)位受阻；Aug 11可以誘導(dǎo)衰老細(xì)胞 Stat3．DNA的結(jié)合；WI－3 8細(xì)胞主要分泌 MMP－2，其活性在衰老細(xì)胞中 明顯低于年輕細(xì)胞；衰老細(xì)胞TIMPl 蛋白的表達(dá)明顯高于年輕細(xì)胞， Aug 11能夠上調(diào)衰老細(xì)胞 TIMPl的表達(dá)，這一作用依賴于 Stat3的活化。 從本實(shí)驗(yàn)可以看出，STAT信號(hào)通路介導(dǎo)了衰老信號(hào)，參與調(diào)控下游基因 的表達(dá)。本研究初步揭示了衰老細(xì)胞形態(tài)、生理功能發(fā)生改變的分子機(jī) 制，Aug 11參與衰老的機(jī)理，提示通過應(yīng)用 ACEI或 ATI RA阻斷 RAS系 統(tǒng)，直接或間接干預(yù) Aug 11的信號(hào)通路，可阻滯 Aug 11上調(diào) T側(cè)l的表 達(dá)，有可能成為延緩衰老、組織硬化進(jìn)程的有效方法。
【圖文】：

圖1.4.EMsA檢測(cè)Angn誘導(dǎo)wl一38細(xì)胞sIF.DNA結(jié)合的量效、時(shí)效作用及特異性.不同濃度的劫911(l)oM，對(duì)照:(2)10一‘M:(3)10一7M:(4)10一喻:(5)10一，M作用于細(xì)胞3伽rnjn;10一喻的劫911刺激細(xì)胞不同時(shí)間(6)omin，對(duì)照;(7)15n五n;(s)3伍nin;(9妙smm:(10)60min;(11)gotnjn;(12)120n五n;(13)10一SM的燈，受體阻斷劑valsartan先作用于細(xì)胞30mill后，10一6M的Angn再刺激細(xì)胞30r正n;(14)10一SM的AT:受體阻斷劑cGP42112A先作用于細(xì)胞30t川n后，10一MAngn再刺激細(xì)胞30n五n;(l5)50倍非標(biāo)記特異探針競爭拮抗;(16)非特異探針NF一KB.同位素標(biāo)記的探針，可完全拮抗活化的S正與標(biāo)記探針的結(jié)合，而加同樣數(shù)量的非特異的探針NF一KB并無此影響，說明形成的SIF復(fù)合物與DNA探針之間的結(jié)合是特異的。并且Angll誘導(dǎo)的s正一DNA結(jié)合，可被ATI受體阻斷劑、恤lsartan所阻斷，但并不受ATZ受體阻斷劑CGP42112A的影響，進(jìn)一步說明Angn誘導(dǎo)Wl一38細(xì)胞stat3、Statl的活化是通過其ATI受體介導(dǎo)的(圖1.4)。，

第四軍醫(yī)大學(xué)博士研究生論文)，表明S正復(fù)合物由p一stat3和p一statl，Angn刺激wi一38后，主要誘導(dǎo)以p一st次p一stat3和p一statl形成的異源二聚體，而p一statl形成的同源二聚體sIF一C含+.+++lA且911一。一6M一+
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R339.38

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本文編號(hào)：2707771