本文關(guān)鍵詞：人Scn5a基因及PRKAG2基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞模型建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 PRKAG2基因編碼單磷酸腺苷活化的蛋白激酶（adenosinemonophosphate activated protein kinase，AMPK）的γ2亞基，，AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于身體各個(gè)組織與細(xì)胞中，也包括心臟組織。由于PRKAG2基因突變可導(dǎo)致AMPK功能障礙，而引起一系列的心臟疾病，因而將這類疾病命名為PRKAG2心臟綜合征。這是一種常染色體顯性遺傳性心臟病，是由于編碼AMPK γ2亞基的PRKAG2基因發(fā)生了點(diǎn)突變而導(dǎo)致的心臟疾病，主要表現(xiàn)為家族性的心肌肥厚、心室預(yù)激和心肌糖原沉積。目前國外共發(fā)現(xiàn)了17個(gè)PRKAG2心臟綜合征的家系，并對其進(jìn)行了基因分析，共發(fā)現(xiàn)了11種基因突變，其中包括1種移碼突變和10種錯(cuò)義突變，并且發(fā)現(xiàn)所有突變位點(diǎn)的均位于cystathionine-β-synthase（CBS）功能區(qū)域內(nèi)。2007年由本實(shí)驗(yàn)室首次報(bào)道了一個(gè)國內(nèi)患有PRKAG2心臟綜合征的家系，并對其進(jìn)行了基因分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的PRKAG2突變位點(diǎn)——glycolamine (100) to serine（G100S），令我們感興趣的是這個(gè)位點(diǎn)區(qū)別于國外之前報(bào)道的所有突變位點(diǎn)，它位于非CBS區(qū)域，而CBS區(qū)域基因測序完全正常，本實(shí)驗(yàn)室對這個(gè)新的突變位點(diǎn)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，擬揭示漢族人PRKAG2心臟綜合征的發(fā)病機(jī)制。經(jīng)過前期研究發(fā)現(xiàn)，PRKAG2的G100S突變位點(diǎn)導(dǎo)致AMPK的活性改變；動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AMPKγ2亞基的突變體可導(dǎo)致CCL細(xì)胞及斑馬魚心肌細(xì)胞糖原沉積及心肌肥厚，這與國外研究發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致，因而本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究PRKAG2的G100S突變在PRKAG2心臟綜合征心律失常發(fā)生中的作用機(jī)制。 目的 本實(shí)驗(yàn)將人心肌細(xì)胞鈉離子通道（Scn5a）分別與人PRKAG2基因野生型、R302Q突變體及G100S突變體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，為今后研究PRKAG2基因突變對心肌細(xì)胞鈉離子通道的影響奠定基礎(chǔ)。 方法 1.人PRKAG2基因野生型、R302Q突變體及G100S突變體過表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-7.1-PRKAG2的構(gòu)建及HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染； 2.人Scn5a過表達(dá)載體Pcdh-GFP-Scn5a的構(gòu)建及HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染； 3.人Scn5a過表達(dá)載體Pcdh-GFP-Scn5a分別與人PRKAG2基因野生型、R302Q突變體及G100S突變體過表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-7.1-PRKAG2共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞；通過PCR技術(shù)、電泳、基因測序檢測載體構(gòu)建結(jié)果，通過real time PCR、western blot、免疫熒光檢測檢測HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果。 結(jié)果 1.成功構(gòu)建人PRKAG2基因野生型、R302Q突變體及G100S突變體過表達(dá)載體及完成HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。 （1）PRKAG2基因野生型過表達(dá)質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-7.1-PRKAG2基因測序結(jié)果與人PRKAG2基因CDS序列一致。 （2）PRKAG2基因野生型過表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-7.1-PRKAG2轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48小時(shí)后，經(jīng)過細(xì)胞免疫熒光染色后，可在熒光顯微鏡下看到紅色熒光；細(xì)胞提取總RNA進(jìn)行real time PCR驗(yàn)證，轉(zhuǎn)染組RNA表達(dá)量明顯高于對照組；收細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行western blot驗(yàn)證，轉(zhuǎn)染組蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯高于對照組。 （3）R302Q突變體及G100S突變體質(zhì)粒測序，測序結(jié)果與預(yù)期突變結(jié)果一致。 2.成功構(gòu)建人Scn5a過表達(dá)載體pCDH-GFP-Scn5a及轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。 （1）過表達(dá)質(zhì)粒Pcdh-GFP-Scn5a基因測序與人Scn5a基因CDS序列一致。 （2）過表達(dá)質(zhì)粒Pcdh-GFP-Scn5a轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48小時(shí)后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞可看到綠色熒光；細(xì)胞提取總RNA進(jìn)行real time PCR驗(yàn)證，轉(zhuǎn)染組RNA表達(dá)量明顯高于對照組；細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行western blot驗(yàn)證，轉(zhuǎn)染組蛋白質(zhì)表達(dá)量高于對照組。 3.成功完成人Scn5a過表達(dá)載體Pcdh-GFP-Scn5a分別與人PRKAG2基因野生型、R302Q突變體及G100S突變體共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞。 （1）細(xì)胞免疫熒光染色驗(yàn)證，F(xiàn)LAG及GFP標(biāo)簽均表達(dá)，分別顯示出紅色熒光和綠色熒光。 （2）共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48h后收細(xì)胞提取總RNA進(jìn)行Real time PCR驗(yàn)證，Scn5a基因轉(zhuǎn)錄RNA在單獨(dú)轉(zhuǎn)染Scn5a組、Scn5a和PRKAG2基因野生型共轉(zhuǎn)組、Scn5a和R302Q突變體共轉(zhuǎn)組、Scn5a和G100S突變體共轉(zhuǎn)組均可檢測到，而在空白對照組為檢測到；PRKAG2基因轉(zhuǎn)錄RNA在Scn5a和PRKAG2基因野生型共轉(zhuǎn)組含量高，而在Scn5a組、Scn5a和R302Q突變體共轉(zhuǎn)組、Scn5a和G100S突變體共轉(zhuǎn)組含量較低。 （3）共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48h后收細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，Scn5a基因在單獨(dú)轉(zhuǎn)染Scn5a組、Scn5a和野生型共轉(zhuǎn)組、Scn5a和R302Q突變體共轉(zhuǎn)組、Scn5a和G100S突變體共轉(zhuǎn)組均有表達(dá)，而在空白對照組沒表達(dá)；PRKAG2基因在Scn5a和野生型PRKAG2共轉(zhuǎn)組高表達(dá)，而在Scn5a組、Scn5a和R302Q突變體共轉(zhuǎn)組、和G100S突變體共轉(zhuǎn)組表達(dá)量較低。 結(jié)論 本課題成功構(gòu)建了人PRKAG2野生型、R302Q突變體及G100S突變體的過表達(dá)載體，同時(shí)成功構(gòu)建了人Scn5a的過表達(dá)載體，并且完成了人Scn5a分別與人PRKAG2野生型、R302Q突變體及G100S突變體共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞內(nèi)，為進(jìn)一步研究PRKAG2R302Q突變體及G100S突變體對心肌細(xì)胞鈉離子通道的影響奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：單磷酸腺苷活化的蛋白激酶 突變 心肌細(xì)胞鈉離子通道 共轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 英文縮略詞10-12
• 前言12-14
• 第一部分 人 PRKAG2 基因野生型過表達(dá)質(zhì)粒載體p3×FLAGCMV7.1PRKAG2 的構(gòu)建、R302Q 及 G100S 突變體的過表達(dá)載體構(gòu)建及人 PRKAG2 基因野生型 HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染14-39
• 一、材料14-16
• 二、方法16-27
• 三、結(jié)果27-39
• 第二部分 人 Scn5a 過表達(dá)載體 PcdhGFPScn5a 構(gòu)建及 HEK 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染39-59
• 一、材料39-41
• 二、方法41-50
• 三、結(jié)果50-59
• 第三部分 人 Scn5a 過表達(dá)載體 PcdhGFPScn5a 分別與野生型人 PRKAG2 過表達(dá)載體 p3×FLAGCMV7.1 PRKAG2、R302Q 突變體及 G100S 突變體共轉(zhuǎn) HEK293T 細(xì)胞59-72
• 一、材料59-60
• 二、方法60-66
• 三、結(jié)果66-72
• 討論72-73
• 小結(jié)73-74
• 參考文獻(xiàn)74-77
• 全文總結(jié)77-78
• 綜述78-85
• 參考文獻(xiàn)82-85
• 發(fā)表論文85-86
• 致謝86

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張靜;鄭興;秦永文;周炳炎;吳弘;王洪如;;家族性傳導(dǎo)系統(tǒng)異常伴心室預(yù)激及心肌肥厚一家系調(diào)查分析[J];中華心血管病雜志;2007年03期

  本文關(guān)鍵詞：人Scn5a基因及PRKAG2基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞模型建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：270725