本文關鍵詞：葫蘆素E對脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥反應的抑制作用及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 葫蘆素E（cucurbitacin E，CuE）是從葫蘆科屬植物中分離得到的四環(huán)三萜類天然化合物，具有廣泛的生物學活性,包括抗炎和抗腫瘤作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆素類化合物具有改變多種腫瘤細胞形態(tài)，破壞細胞骨架，使細胞周期發(fā)生阻滯的作用,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。但其抗炎機制尚沒有完全闡明。本研究以CuE為主，分析其對脂多糖（LPS）激活的小鼠巨噬細胞RAW264.7表達的腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1（IL-1）等炎癥反應的影響，以及對MAPKs信號通路、NF-κB信號通路蛋白活化和NF-κB的核轉位的作用，在細胞和分子水平探討其抗炎機制。 方法 1.小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞置于含體積10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37C、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2.配置不同濃度的CuE（0.16mol/L、4mol/L、20mol/L、100mol/L）處理RAW264.7細胞48小時，用MTS方法檢測CuE對細胞存活的影響，，用吸光度為490nm的酶標儀檢測吸光率，從而計算細胞存活率和半數(shù)抑制率(IC50)，根據(jù)結果選擇合適藥物濃度。 3.不同濃度的CuE處理LPS活化的RAW264.7細胞12小時后，用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化，拍照記錄。采用免疫印跡方法和蛋白定量方法檢測G-actin和F-actin的表達量，通過細胞免疫熒光染色方法檢測細胞內-actin的分布。 4.碘化丙錠（PI）染色法檢測LPS活化的RAW264.7細胞與不同濃度的CuE共同孵育24小時后的細胞周期變化。 5.用細胞因子染色法結合流式細胞儀檢測，分析CuE對LPS活化的RAW264.7表達細胞因子TNF-α和IL-1的影響。 6.用免疫印跡法檢測MAPKs信號通路磷酸化蛋白(p-p38、p-JNK、p-ERK1/2)和NF-κB信號通路蛋白（p-IκB、p-p65、IκB、p65）的水平，以及NF-κB的核轉位的情況。 結果： 1.不同濃度的CuE處理RAW264.7細胞48小時后，細胞增殖隨著CuE濃度的增加而減少，當CuE濃度達到100mol/L時，細胞存活率只有16.540.70%。提示CuE對RAW264.7細胞具有生長抑制作用，計算得到CuE的IC50為7.79mol/L，為進一步實驗藥物濃度的選擇提供了依據(jù)。 2．細胞形態(tài)觀察表明，LPS刺激RAW264.7細胞與對照組相比，細胞體積變大，偽足伸長；加CuE后細胞變圓，偽足消失。 3.免疫印跡結果顯示，G-actin的蛋白含量隨著CuE的加入而減少，而在F-actin量則增多；免疫熒光顯示actin蛋白在細胞內由彌散分布變?yōu)榫奂植肌?4. PI染色顯示，不同濃度的CuE作用LPS刺激活化的RAW264.7細胞24小時后，細胞周期大部分阻滯于G2/M期。 5.細胞因子染色顯示，不同濃度的CuE作用LPS活化的RAW264.7細胞6小時后，細胞因子TNF-α、IL-1的表達量呈劑量依賴性抑制。 6.核質分離實驗顯示，不同濃度的CuE培養(yǎng)LPS活化的RAW264.7細胞4小時后，NF-B蛋白核轉位的量減少，并呈劑量依賴性。 7.免疫印跡顯示，不同濃度的CuE對LPS活化的RAW264.7細胞的MAPKs信號通路和NF-B信號通路蛋白并無太大的影響。結論： 1. CuE能夠劑量依賴性的抑制RAW264.7細胞增殖，改變細胞形態(tài)，使actin聚集，并使其細胞周期阻抑于G2/M期，這些可能是CuE起到抗炎作用的機制之一。 2. CuE能夠劑量依賴性抑制細胞因子TNF-α和IL-1的表達，以及NF-B蛋白的核轉位，但對MAPKs信號通路和NF-B信號通路活化沒有顯著的影響，表明CuE可能是通過抑制LPS活化的RAW264.7細胞的NF-B核轉位，導致細胞因子TNF-α和IL-1的表達量減少，從而表現(xiàn)出抗炎效應。
【關鍵詞】：葫蘆素E 小鼠巨噬細胞系RAW264.7 脂多糖（LPS） 細胞骨架 NF-κB
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 一、前言10-18
• 1 葫蘆素10
• 2 葫蘆素 E10-14
• 2.1 葫蘆素 E 的化學性質10-11
• 2.2 葫蘆素 E 的抗腫瘤作用11-12
• 2.3 葫蘆素 E 對細胞周期的作用12-13
• 2.4 葫蘆素 E 對細胞骨架的影響13-14
• 3 MAPKs 信號通路14-15
• 4 NF-κB 信號通路15-16
• 5 本課題的研究目的和意義16-18
• 二、實驗材料與設備18-22
• 1. 實驗細胞株18
• 2. 主要試劑18-19
• 3. 主要儀器19
• 4. 主要溶液配方19-22
• 三、實驗方法與步驟22-27
• 1. 細胞培養(yǎng)22
• 2. 細胞增殖測定22
• 3. 細胞形態(tài)學觀察22-23
• 4. PI 染色檢測 CuE 對 RAW264.7 巨噬細胞周期的影響23
• 5. 細胞免疫熒光觀察 CuE 對 RAW 264.7 巨噬細胞的影響23-24
• 6. 細胞內細胞因子染色檢測 CuE 對 RAW 264.7 巨噬細胞內 TNF-α的表達24
• 7. 核質分離蛋白抽提和免疫印跡分析24-26
• 8. 統(tǒng)計學分析26-27
• 四、實驗結果27-36
• 1. CuE 對小鼠巨噬細胞 RAW264.7 細胞存活率的影響27
• 2. CuE 對 LPS 活化的小鼠巨噬細胞 RAW 264.7 細胞形態(tài)的影響27-28
• 3. CuE 對 LPS 活化的小鼠巨噬細胞 RAW 264.7 細胞骨架的影響28-30
• 4. CuE 對 LPS 活化的小鼠巨噬細胞 RAW 264.7 細胞周期的影響30-32
• 5. CuE 對 LPS 活化的 RAW 264.7 細胞表達細胞因子 TNF-α和 IL-1 的影響32-33
• 6. CuE 對 LPS 活化的 RAW 264.7 細胞 MAPKs 信號通路和 NF-κB 信號通路的影響33-34
• 7. CuE 對 LPS 活化的 RAW264.7 細胞 NF-κB 蛋白核轉位的影響34-36
• 五、討論36-39
• 參考文獻39-47
• 全文總結47-48
• 發(fā)表論文48-49
• 致謝49

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：葫蘆素E對脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥反應的抑制作用及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：270757