【摘要】：自從Krogh等1970年發(fā)現(xiàn)抗角蛋白自身抗體(anti-keratin autoantibody，AK auto Ab)以來，眾多學者對其天然存在、生物學特性、生理及病理意義等方面進行了較為廣泛的探索。目前研究提示AK auto Ab可能參與了皮膚的多種生理和病理過程，并具有重要的調節(jié)作用。然而，由于實驗方法等方面的局限性，以往對于AK auto Ab生理、病理意義的認識仍較為有限，而且以往常規(guī)的方法無法進行AK auto Ab產生機制等關鍵問題的研究。因此，為了全面研究AK auto Ab的特性并探討其產生機制，建立一種理想的模式生物進行在體研究就顯得非常必要。 近年來抗體轉基因動物技術的成熟和應用為徹底闡明上述問題提供了可能。按照抗體基因表達的等位基因排斥定律，如果將經過重排的抗體基因導入轉基因小鼠的基因組，那么這些基因將會先于內源抗體基因表達，而且內源抗體基因將不再發(fā)生重排，該轉基因小鼠將主要表達同一抗原特異性的B細胞。這樣就可能得到高表達某一種抗體的動物模型來分析該抗體的生物學作用，也可以獲得足夠數量的同一 第四軍醫(yī)大學博士學位論文 抗原特異性的B細胞以分析其選擇/耐受機理。 本課題組以往的研究進展己經為轉基因小鼠的建立奠定了良好的 基礎:我們應用未免疫小鼠B細胞與骨髓瘤細胞融合，成功篩選到了 4株分泌抗角蛋白IgM抗體的雜交瘤，并發(fā)現(xiàn)單克隆抗角蛋白抗體的 親和力差異很大。這些更具天然性的未免疫小鼠雜交瘤抗體的獲得不 僅有助于我們進一步探討AK auto Ab的特性和生物學作用，更為深入 研究AK auto Ab的產生機制等長久以來困擾我們的難題提供了非常好 的實驗材料。 本研究首先從小鼠表皮提取了小鼠角蛋白，然后應用NH4SCN洗 脫法比較了天然抗角蛋白雜交瘤抗體的相對親和力，選擇高親和力的 抗角蛋白抗體用以構建轉基因小鼠，并初步進行了表型分析。 一、轉基因載體構建及表達 采用RT-PCR方法克隆分泌AK auto Ab的雜交瘤3B4的重鏈和輕 鏈可變區(qū)基因，連接抗體轉錄啟動子、增強子及恒定區(qū)基因序列，構 建成重鏈轉基因質粒pIC林一VZH:和輕鏈轉基因質粒pBsck一Zvk4。電穿 孔法進行了體外真核細胞轉染，ELISA、RJ’- PCR、流式細胞儀方法驗 證轉基因載體可以表達抗體3B4基因。 二、抗體重鏈轉基因小鼠建立及基因型分析 將線性化的質粒顯微注射入CBA X C57BL/6小鼠的受精卵細胞的 雄前核內，然后導入假孕雌鼠的輸卵管。共注射約200枚卵，娩出小 鼠80只。提取小鼠尾巴基因組DNA進行PCR分析，共獲得12只轉 基因陽性小鼠。Southem blot分析進一步證實轉基因存在。 三、抗體重鏈轉基因小鼠表型分析 以anti一19入刀anti一190抗體、anti一IgN燈anti一IgMa/anti一IgMb抗體分析轉 基因小鼠B細胞等位基因排斥情況，發(fā)現(xiàn)50%一80%的B細胞表達轉 基因編碼的IgM;EuSA分析轉基因小鼠外周血中抗角蛋白IgM和總 第四軍醫(yī)大學博士學位論文 [gM水平，發(fā)現(xiàn)部分轉基因小鼠的抗角蛋白IgM水平明顯高于對照小 鼠，而總IgM水平沒有差異。 以anti一B220/anti一IgM抗體分析了轉基因小鼠中樞和外周B細胞數 的變化及成熟情況，，發(fā)現(xiàn)骨髓、脾和腹腔的成熟B細胞數都明顯下降， 其中骨髓和腹腔約為對照野生鼠的一半，而脾更低至三分之一。 Anti一19樹anti一CDS抗體進一步分析B細胞亞群的情況，結果骨髓和脾 的CDS十B細胞/C DS一B細胞比例與對照沒有差異，而腹腔的CDS十B細 胞明顯增多。從而提示，腹腔里增加的CDS+B細胞可能導致了血清里 抗角蛋白IgM水平的提高。 四、AKaut0Ab產生的細胞基礎研究 應用ELISPOT方法和EL工SA方法對體外培養(yǎng)的轉基因小鼠和野生 小鼠的脾和腹腔細胞中分泌AK autOAb的細胞數量及分泌AK autoAb 的水平進行了分析。結果發(fā)現(xiàn)野生小鼠脾細胞中分泌AK autoAb的細 胞數遠遠少于腹腔細胞，其分泌的抗體滴度也顯著低于腹腔細胞;在 轉基因小鼠獲得了相同的結果，其腹腔中分泌AK autoAb的B細胞數 又遠遠多于野生小鼠。 結合anti一CDS抗體的分析結果，我們有足夠的信心得出這樣的結 論:腹腔B細胞是AK auto Ab的主要來源，轉基因小鼠腹腔內增高的 CDS毛細胞是產生AK autoAb的主要細胞。 本研究成功建立了AK auto Ab的轉基因小鼠模型，為進一步在體 研究AK auto Ab的功能作用奠定了良好的基礎;并利用轉基因小鼠初 步分析了AK auto Ab的產生機理，明確了AK auto Ab產生的細胞基礎。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 張?zhí)┥�，李承新，劉玉峰，王�?銀屑病患者鱗屑內AK auto Ab的純化和鑒定[J];第四軍醫(yī)大學學報;1994年02期

2 劉玉峰,劉彥仿,丁華野,張?zhí)┥?樊平申,廖文俊;抗角蛋白自身抗體對植入自身表皮作用的動態(tài)觀察[J];第四軍醫(yī)大學學報;1991年06期

3 李冰,李巍,劉玉峰,李承新,趙小東,高天文;抗角蛋白自身抗體對豚鼠銀屑病樣模型的影響[J];中國皮膚性病學雜志;2002年02期

4 王剛,王琰,化冰,劉曉琳,喬媛媛;人源性天然抗體庫的構建及初步鑒定[J];細胞與分子免疫學雜志;2002年01期

5 王剛!710032西安,王琰,化冰,喬媛媛,劉玉峰!710032西安;鏈替換技術提高抗角蛋白人Fab抗體的親和力[J];中華微生物學和免疫學雜志;2001年02期

6 李承新!710032西安,劉玉峰!710032西安,劉彥仿!710032西安,張衍國!710032西安;純化的抗角蛋白自身抗體對培養(yǎng)角朊細胞的作用[J];中華皮膚科雜志;1996年02期

本文編號：2702977