【摘要】： 隨著人類基因組及多種模式生物基因組測序的完成，擺在人們面前的任務就是要從這些簡單而復雜的核酸序列中，發(fā)現(xiàn)和尋找新的基因，并對所有的基因的結構、功能及調控等方面進行研究，以期獲得對生命本質和規(guī)律的認識。本論文正是基于這樣的背景之下，通過生物信息學分析，，利用基因功能互補分析方法和酵母雙雜交等技術，對來自人體的兩個新基因TRPT1和PGL29的結構、功能及表達定位等方面進行了初步探討。主要結果如下： TRPT1全長cDNA序列共963bp，含有一個編碼253aa的開放閱讀框，其5’-端和3’-端分別含有一個處于同一讀框的終止密碼和poly(A)加尾信號，該讀框編碼蛋白的預測分子質量為27.8kDa，等電點為10.13。和TRPT1基因位于基因組中染色體11q12.3區(qū)，跨越長度為2.5kb。它包含8個外顯子和7個內含子，除第一個內含子的5’-端和外顯子的邊界外，其余均符合GT-AG規(guī)則。 TRPT1基因編碼的蛋白質TRPT1與釀酒酵母中功能已知的Tpt1p蛋白有40％的同源性，但兩者在核苷酸水平上同源性很低。TRPT1也與來自其它不同物種的諸多蛋白序列有不同程度的同源性，但這些蛋白的大多數為未經實驗證實的可能蛋白(hypothetical proteins)。在TRPT1蛋白的氨基酸序列的中部區(qū)域，還有一個唯一的功能未知的DUF60或者KptA功能域。此外，在整個氨基酸序列中，還有4個蛋白激酶C磷酸化位點、3個酪氨酸激酶Ⅱ位點等不同的修飾位點。 酵母TPT1是一個生長必需的基因，其編碼產物為一種tRNA剪接過程中去除剪接點處形成的2’-磷酸基團的tRNA 2’-磷酸轉移酶。根據TRPT1與模式生物酵母Tpt1p的同源性，我們構建了TPT1的缺失菌株，利用plasmid shuffle技術，發(fā)現(xiàn)TRPT1能夠互補酵母TPT1突變的功能，證明TRPT1是TPT1的人類同源基因。結合已有的研究，證明TRPT1蛋白就是tRNA 2’-磷酸轉移酶。互補研究的結果表明人體內存在著與酵母相同的tRNA剪接方式，反映了這種tRNA剪接途徑的高度保守性。同時也證明人體內具有兩種tRNA剪接途徑存在。 0 酵母以雜交篩選、加衛(wèi)工加wn檢測及＊－IP實驗均證明m卜1”且與功能未知的 PIT13蛋；”之間存在著相互作用，說明IMj基因除了參與tRNA剪接之外，還 可能具有其它方面的功能，有待進一步研究。 在引出，”I”衛(wèi)與PIT13的相互作用中，通過系列缺失方法，證＊了TRPTI的功能 區(qū)（即P門出的作用區(qū)〕位于其氨基酸序列的80－220＊。之間，基本上位于OUF60 功能域內。同時，對PIT13 的功能區(qū)也進廳了初步測定，在其氨基酸序列的 c 55－11 oa＊之間 為可能的功能位點。 用來自成人的12種不同組織的分析結果表明，IXET711基因的表達具有組織特 異性差異。其在骨胳肌、心臟中的表達量最為豐富，在其它組織中的表達較低或 者不表達。據此，我們推測；人體內的兩種tRNA剪接方式可能也存在著組織差 異，即：種剪接方式存在于某些組織中，而另一種剪接途徑可能存在于其它組 織中。TRPTI與GFP融合蛋白在細胞內的表達結果，顯示TRPTI主要分布在細胞 核內，這與其具有的參與tRNA剪接成熟的功能是相符合的。 利用『l”RPT及其多種同源性蛋白進行的系統(tǒng)進化樹分析表明，它們能夠將來 O 自不同或者相同類群的物種按照進化關系正確地區(qū)分開來。因此，TRPTI蛋白可 以作為一種進化標記蛋白，用來反映物種間的親緣關系。 PeLfq的全長cDNA序列為1698hp，含有一個編碼260aa的ORF，編碼蛋白 的分子量為28．6kDa，等電點為5．07。PGL29基因定位于染色體16p13．3區(qū)，整 個基因長度4．okb左右。由 8個外顯子和 7個內含子組成。在 PGL29的編碼蛋白 中，共有4個WD40結構域。其全長氨基酸序列與模式生物釀酒酵母中的LSt8P 有 440的問源性。 O 根 據％：729表達菌株對各種氨基酸類似物的抗性測定結果，發(fā)現(xiàn)Pe29與 LSTS并大明確的互補關系。酵母雙雜交篩選結果，也未得到特異地與PGL29相 互作用的直白質分于，因而現(xiàn)有的實驗無法確定該基因的功能。為此，對實驗的 方法、材料選擇及相關基因的背景等方面作了討論。
【圖文】：

從tRNA基因轉錄出來的前體tRNA，首先在內切核酸酶的作用下，分子的5’一端和3’一端，產生5’一端和3’一端兩個外顯子和一個內含子片顯子片段也分別叫做5’一端半分子和3’一端半分子。5’一端半分子的3’一2’，3’一環(huán)狀磷酸基團結構，3’一端外顯子的5’一端為一個輕基基團。接l介材At只N八扮·翻e公“沁s

從而形成了一個完整的分子量約為140kDa的四聚體蛋白分子。p￥到圖2)�；谶@些研究，人們對內切核酸酶的作用機制提出了如下模型(圖3)[18〕。遂璧縫羹談令搶火六幾圖2酵母內切核酸酶結構圖3.內切核酸酶作用機制模型該模型認為內切核酸酶結合到前體tRNA(pre一tRNA)分子后，主要通過SenZp與Sen54p的相互作用測定剪接點到tRNA分子上反密碼子莖的長度或距離，并借助于Sen15p蛋白識別A一I堿基對的相互作用，更加精確地結合到前體tRNA分子上，使內含子的兩個切點準確地被切開，產生5，一端、3，一端半分子。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：Q987

【共引文獻】

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1 李衛(wèi),郭光沁,鄭國

本文編號：2702169