【摘要】： 隨著人類(lèi)基因組及多種模式生物基因組測(cè)序的完成，擺在人們面前的任務(wù)就是要從這些簡(jiǎn)單而復(fù)雜的核酸序列中，發(fā)現(xiàn)和尋找新的基因，并對(duì)所有的基因的結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控等方面進(jìn)行研究，以期獲得對(duì)生命本質(zhì)和規(guī)律的認(rèn)識(shí)。本論文正是基于這樣的背景之下，通過(guò)生物信息學(xué)分析，，利用基因功能互補(bǔ)分析方法和酵母雙雜交等技術(shù)，對(duì)來(lái)自人體的兩個(gè)新基因TRPT1和PGL29的結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)定位等方面進(jìn)行了初步探討。主要結(jié)果如下： TRPT1全長(zhǎng)cDNA序列共963bp，含有一個(gè)編碼253aa的開(kāi)放閱讀框，其5’-端和3’-端分別含有一個(gè)處于同一讀框的終止密碼和poly(A)加尾信號(hào)，該讀框編碼蛋白的預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為27.8kDa，等電點(diǎn)為10.13。和TRPT1基因位于基因組中染色體11q12.3區(qū)，跨越長(zhǎng)度為2.5kb。它包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，除第一個(gè)內(nèi)含子的5’-端和外顯子的邊界外，其余均符合GT-AG規(guī)則。 TRPT1基因編碼的蛋白質(zhì)TRPT1與釀酒酵母中功能已知的Tpt1p蛋白有40％的同源性，但兩者在核苷酸水平上同源性很低。TRPT1也與來(lái)自其它不同物種的諸多蛋白序列有不同程度的同源性，但這些蛋白的大多數(shù)為未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的可能蛋白(hypothetical proteins)。在TRPT1蛋白的氨基酸序列的中部區(qū)域，還有一個(gè)唯一的功能未知的DUF60或者KptA功能域。此外，在整個(gè)氨基酸序列中，還有4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)酪氨酸激酶Ⅱ位點(diǎn)等不同的修飾位點(diǎn)。 酵母TPT1是一個(gè)生長(zhǎng)必需的基因，其編碼產(chǎn)物為一種tRNA剪接過(guò)程中去除剪接點(diǎn)處形成的2’-磷酸基團(tuán)的tRNA 2’-磷酸轉(zhuǎn)移酶。根據(jù)TRPT1與模式生物酵母Tpt1p的同源性，我們構(gòu)建了TPT1的缺失菌株，利用plasmid shuffle技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TRPT1能夠互補(bǔ)酵母TPT1突變的功能，證明TRPT1是TPT1的人類(lèi)同源基因。結(jié)合已有的研究，證明TRPT1蛋白就是tRNA 2’-磷酸轉(zhuǎn)移酶�；パa(bǔ)研究的結(jié)果表明人體內(nèi)存在著與酵母相同的tRNA剪接方式，反映了這種tRNA剪接途徑的高度保守性。同時(shí)也證明人體內(nèi)具有兩種tRNA剪接途徑存在。 0 酵母以雜交篩選、加衛(wèi)工加wn檢測(cè)及＊－IP實(shí)驗(yàn)均證明m卜1”且與功能未知的 PIT13蛋；”之間存在著相互作用，說(shuō)明IMj基因除了參與tRNA剪接之外，還 可能具有其它方面的功能，有待進(jìn)一步研究。 在引出，”I”衛(wèi)與PIT13的相互作用中，通過(guò)系列缺失方法，證＊了TRPTI的功能 區(qū)（即P門(mén)出的作用區(qū)〕位于其氨基酸序列的80－220＊。之間，基本上位于OUF60 功能域內(nèi)。同時(shí)，對(duì)PIT13 的功能區(qū)也進(jìn)廳了初步測(cè)定，在其氨基酸序列的 c 55－11 oa＊之間 為可能的功能位點(diǎn)。 用來(lái)自成人的12種不同組織的分析結(jié)果表明，IXET711基因的表達(dá)具有組織特 異性差異。其在骨胳肌、心臟中的表達(dá)量最為豐富，在其它組織中的表達(dá)較低或 者不表達(dá)。據(jù)此，我們推測(cè)；人體內(nèi)的兩種tRNA剪接方式可能也存在著組織差 異，即：種剪接方式存在于某些組織中，而另一種剪接途徑可能存在于其它組 織中。TRPTI與GFP融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)結(jié)果，顯示TRPTI主要分布在細(xì)胞 核內(nèi)，這與其具有的參與tRNA剪接成熟的功能是相符合的。 利用『l”RPT及其多種同源性蛋白進(jìn)行的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，它們能夠?qū)?lái) O 自不同或者相同類(lèi)群的物種按照進(jìn)化關(guān)系正確地區(qū)分開(kāi)來(lái)。因此，TRPTI蛋白可 以作為一種進(jìn)化標(biāo)記蛋白，用來(lái)反映物種間的親緣關(guān)系。 PeLfq的全長(zhǎng)cDNA序列為1698hp，含有一個(gè)編碼260aa的ORF，編碼蛋白 的分子量為28．6kDa，等電點(diǎn)為5．07。PGL29基因定位于染色體16p13．3區(qū)，整 個(gè)基因長(zhǎng)度4．okb左右。由 8個(gè)外顯子和 7個(gè)內(nèi)含子組成。在 PGL29的編碼蛋白 中，共有4個(gè)WD40結(jié)構(gòu)域。其全長(zhǎng)氨基酸序列與模式生物釀酒酵母中的LSt8P 有 440的問(wèn)源性。 O 根 據(jù)％：729表達(dá)菌株對(duì)各種氨基酸類(lèi)似物的抗性測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Pe29與 LSTS并大明確的互補(bǔ)關(guān)系。酵母雙雜交篩選結(jié)果，也未得到特異地與PGL29相 互作用的直白質(zhì)分于，因而現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)無(wú)法確定該基因的功能。為此，對(duì)實(shí)驗(yàn)的 方法、材料選擇及相關(guān)基因的背景等方面作了討論。
【圖文】：

從tRNA基因轉(zhuǎn)錄出來(lái)的前體tRNA，首先在內(nèi)切核酸酶的作用下，分子的5’一端和3’一端，產(chǎn)生5’一端和3’一端兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子片顯子片段也分別叫做5’一端半分子和3’一端半分子。5’一端半分子的3’一2’，3’一環(huán)狀磷酸基團(tuán)結(jié)構(gòu)，3’一端外顯子的5’一端為一個(gè)輕基基團(tuán)。接l介材At只N八扮·翻e公“沁s

從而形成了一個(gè)完整的分子量約為140kDa的四聚體蛋白分子。p￥到圖2)�；谶@些研究，人們對(duì)內(nèi)切核酸酶的作用機(jī)制提出了如下模型(圖3)[18〕。遂璧縫羹談令搶火六幾圖2酵母內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)圖3.內(nèi)切核酸酶作用機(jī)制模型該模型認(rèn)為內(nèi)切核酸酶結(jié)合到前體tRNA(pre一tRNA)分子后，主要通過(guò)SenZp與Sen54p的相互作用測(cè)定剪接點(diǎn)到tRNA分子上反密碼子莖的長(zhǎng)度或距離，并借助于Sen15p蛋白識(shí)別A一I堿基對(duì)的相互作用，更加精確地結(jié)合到前體tRNA分子上，使內(nèi)含子的兩個(gè)切點(diǎn)準(zhǔn)確地被切開(kāi)，產(chǎn)生5，一端、3，一端半分子。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類(lèi)號(hào)】：Q987

【共引文獻(xiàn)】

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1 李衛(wèi),郭光沁,鄭國(guó)

本文編號(hào)：2702169