【摘要】：乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白(Hepatitis B X-interacting protein, HBXIP)是一個(gè)分子量為19kDa的蛋白,因其可與乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B virus x protein, HBx)的C端特異性結(jié)合而得名,HBXIP在脊椎動(dòng)物中非常保守,是細(xì)胞組成型蛋白。HBXIP在腫瘤細(xì)胞的增殖、有絲分裂、中心體動(dòng)態(tài)和細(xì)胞周期進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。HBXIP還參與mTORC1復(fù)合體形成,參與rnTORC1信號(hào)通路。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)HBXIP具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的作用,但是其調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。Skp2是一種潛在的癌蛋白,其表達(dá)對(duì)于細(xì)胞進(jìn)入S期是必須的,并且在多種腫瘤中高表達(dá),參與DNA復(fù)制,細(xì)胞周期,凋亡,侵襲,轉(zhuǎn)移等過程。本研究探討HBXIP和Skp2的關(guān)系及其在腫瘤發(fā)生過程中的作用及分子機(jī)制,主要研究結(jié)果如下： 第一部分：HBXIP促進(jìn)乳腺癌的增殖作用 我們應(yīng)用組織芯片和免疫組化方法在49例乳腺癌組織中檢測(cè)了HBXIP和Skp2蛋白表達(dá)的相關(guān)性,結(jié)果顯示HBXIP和Skp2的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)。隨后我們又用時(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)了30例新鮮乳腺癌組織中HBXIP和Skp2的mRNA的表達(dá)水平,得到了相似的結(jié)果。為了研究HBXIP對(duì)Skp2表達(dá)的影響,我們應(yīng)用免疫印記實(shí)驗(yàn)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了4種乳腺癌細(xì)胞系中HBXIP和Skp2的蛋白和mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示在MCF-7和SK-BR-3細(xì)胞中,HBXIP以劑量依賴方式上調(diào)Skp2蛋白和mRNA的表達(dá),而在LM-MCF-7和MCF-7-HBXIP細(xì)胞中干擾HBXIP, Skp2蛋白和mRNA的表達(dá)可以劑量依賴的方式下調(diào)。我們進(jìn)一步檢測(cè)了轉(zhuǎn)染了HBXIP后乳腺癌細(xì)胞中Skp2下游蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示Skp2下游蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與Skp2一致。為了研究HBXIP上調(diào)Skp2的分子機(jī)制,我們利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)了HBXIP對(duì)Skp2啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果顯示HBXIP在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中可以劑量依賴的方式增強(qiáng)Skp2啟動(dòng)子的活性；而在LM-MCF-7和MCF-7-HBXIP細(xì)胞中干擾HBXIP,則可以劑量依賴的方式下調(diào)Skp2啟動(dòng)子的活性。免疫組化結(jié)果顯示HBXIP可定位于細(xì)胞核中,表明HBXIP可能發(fā)揮核功能。隨機(jī)將Skp2啟動(dòng)子區(qū)域分為3個(gè)片段,分別是-776/-567,-640/-443,-464/-250。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)顯示HBXIP可以結(jié)合Skp2啟動(dòng)子-640/-443片段。我們通過在線啟動(dòng)子分析軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Skp2啟動(dòng)子-640/-443區(qū)域內(nèi)存在潛在的轉(zhuǎn)錄因子(E2F1)結(jié)合位點(diǎn)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Co-IP)證實(shí)HBXIP(?)(?)Skp2蛋白可以相互結(jié)合。電泳遷移率(EMSA)實(shí)驗(yàn)顯示HBXIP可能通過轉(zhuǎn)錄因子E2F1與Skp2啟動(dòng)子結(jié)合。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示E2F1突變位點(diǎn)后HBXIP上調(diào)Skp2啟動(dòng)子活性的能力下降。再次證實(shí)HBXIP通過與轉(zhuǎn)錄因子E2F1位點(diǎn)結(jié)合并激活Skp2的啟動(dòng)子區(qū)域。另一方面,HBXIP在乳腺癌細(xì)胞中可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子E2F1的蛋白和mRNA的表達(dá)水平,提示HBXIP可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控Skp2的表達(dá)。進(jìn)一步的MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)HBXIP促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖是通過調(diào)節(jié)Skp2實(shí)現(xiàn)的,而流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明HBXIP促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入S期的實(shí)現(xiàn)的,此過程中Skp2發(fā)揮重要作用。動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)表明,HBXIP通過Skp2促進(jìn)乳腺癌腫瘤的生長(zhǎng)。綜上所述,HBXIP通過轉(zhuǎn)錄因子E2F1增強(qiáng)Skp2啟動(dòng)子活性,進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。 第二部分：HBXIP促進(jìn)卵巢癌的遷移作用 我們應(yīng)用組織芯片和免疫組化方法在80例卵巢癌組織中檢測(cè)了HBXIP和Skp2蛋白表達(dá)的相關(guān)性,結(jié)果顯示HBXIP和Skp2的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)。為了研究卵巢癌中HBXIP的表達(dá)對(duì)Skp2的影響,我們應(yīng)用免疫印記實(shí)驗(yàn)(?)RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了2種卵巢癌細(xì)胞系中HBXIP和Skp2的蛋白(?)mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示在2種卵巢癌SKOV3(?)(?)CAOV3細(xì)胞中,HBXIP以劑量依賴方式上調(diào)Skp2的蛋白和mRNA的表達(dá)。隨后我們利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)了HBXIP對(duì)Skp2啟動(dòng)子活性的影響,結(jié)果顯示HBXIP在卵巢癌SKOV3和CAOV3細(xì)胞中可以劑量依賴的方式增強(qiáng)Skp2啟動(dòng)子的活性。卵巢癌病理組織免疫組化結(jié)果顯示HBXIP可定位于細(xì)胞核中,表明HBXIP可能發(fā)揮核功能。我們隨機(jī)將Skp2啟動(dòng)子區(qū)域分為3個(gè)片段,分別是-776/-567,-640/-443,-464/-250。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)顯示HBXIP可以結(jié)合Skp2啟動(dòng)子-640/-443區(qū)域。通過在線啟動(dòng)子分析軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Skp2啟動(dòng)子-640/-443區(qū)域內(nèi)包含潛在的轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn),隨后我們合成了Spl結(jié)合位點(diǎn)突變的Skp2啟動(dòng)子,熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示在卵巢癌SKOV3和CAOV3細(xì)胞中HBXIP上調(diào)Skp2突變啟動(dòng)子活性的能力下降。再次證實(shí)HBXIP通過轉(zhuǎn)錄因子Sp1位點(diǎn)結(jié)合到Skp2的啟動(dòng)子區(qū)域。進(jìn)一步的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)HBXIP促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移是通過調(diào)節(jié)Skp2實(shí)現(xiàn)的。綜上所述,HBXIP通過轉(zhuǎn)錄因子Sp1增強(qiáng)Skp2啟動(dòng)子活性,進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移。 綜上所述,本研究在分子、細(xì)胞、動(dòng)物和臨床標(biāo)本等多個(gè)層面對(duì)HBXIP和Skp2與腫瘤的關(guān)系進(jìn)行了深入細(xì)致的研究。我們的研究結(jié)果顯示：HBXIP是一種新的癌蛋白,可以通過多種途徑影響多種腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移的功能。上述研究可以為深入揭示HBXIP的致病機(jī)理提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),并進(jìn)一步豐富HBXIP的致癌的分子機(jī)制,為腫瘤的預(yù)防和治療提供新的理論價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373.21

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 楊念念;嚴(yán)亞瓊;龔潔;張思維;鄭榮壽;陳萬青;;中國(guó)2003～2007年卵巢癌發(fā)病與死亡分析[J];中國(guó)腫瘤;2012年06期

2 楊玲;李連弟;陳育德;D．M．Parkin;;中國(guó)乳腺癌發(fā)病死亡趨勢(shì)的估計(jì)與預(yù)測(cè)[J];中華腫瘤雜志;2006年06期

3 黃哲宙;陳萬青;吳春曉;鄭榮壽;陳建國(guó);楊念念;王寧;張思維;鄭瑩;;中國(guó)女性乳腺癌的發(fā)病和死亡現(xiàn)況——全國(guó)32個(gè)腫瘤登記點(diǎn)2003—2007年資料分析報(bào)告[J];腫瘤;2012年06期

，

本文編號(hào)：2702155