【摘要】：肝臟是基因治療應(yīng)用中主要的靶向器官，因為它是許多代謝性疾病的靶點，肝臟的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物容易進入血液循環(huán)，而且由于它的顯微解剖結(jié)構(gòu)，也是實現(xiàn)肝靶向基因轉(zhuǎn)移的重要特性之一。肝血竇內(nèi)皮系統(tǒng)占肝表面正弦間隙的6％-8％，這些間隙及微小膽管可以允許生物大分子及納米載體直接轉(zhuǎn)移至肝細胞。 靜脈注射裸DNA，顯示肝臟絕大部分特異性內(nèi)吞，但卻無任何轉(zhuǎn)基因表達水平，只有通過流體動力學／高流速注射的方法才能達到高表達水平，注射體積占體重的8％左右，由于不符合生理條件，故不能應(yīng)用于臨床。然而減小注射壓力及液體量，卻無基因表達水平。載體能夠有效保護血清降解DNA，促進肝臟的特異性轉(zhuǎn)運，與肝細胞特異結(jié)合，明顯提高轉(zhuǎn)基因表達水平，但是目前非病毒載體的最大障礙，就是轉(zhuǎn)基因水平低且瞬時。 病毒載體系統(tǒng)中的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相 第四軍醫(yī)大學博士學位論文 關(guān)病毒載體等，其基因傳遞效率高，體內(nèi)可以感染多種細胞， 故可以通過門靜脈或原位注射的方法，但其仍存在許多難以 克服的局限性，如，逆轉(zhuǎn)錄病毒不能感染非分裂細胞;腺病毒 不能穩(wěn)定整合于宿主細胞基因組內(nèi)，故難以長期穩(wěn)定表達，甚 至可能引起機體強烈的免疫反應(yīng);腺相關(guān)病毒載體容量小，難 以為大片段基因所利用，且制備困難。 非病毒載體基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，是另一種較為安全的方法。 1998年Le。ng等人建立了納米微囊(Nanosphere)包裹非病 毒載體基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。納米微囊直徑80一30Onm;無免疫源性， 包裹轉(zhuǎn)載物可避免其在受體內(nèi)被溶酶體酶降解，同時可包裹 多個轉(zhuǎn)導基因，提高了轉(zhuǎn)染效率;由于采用可降解生物材料 包裹，故明顯提高轉(zhuǎn)載基因的活性并具有長時間緩釋功能， 并可在保持基因活性情況下低溫長時間保存。 對于原位轉(zhuǎn)基因，基因載體未結(jié)合配體，也可以有較高 的轉(zhuǎn)基因表達的水平，通過門靜脈基因轉(zhuǎn)移，大部分被 kupffer細胞特異性內(nèi)吞，因此肝臟表達水平最高，但肺及脾 內(nèi)也有部分轉(zhuǎn)基因表達的水平，但表達水平仍相對較低且瞬 時，但通過膽管基因轉(zhuǎn)移，為肝靶向基因轉(zhuǎn)移提供了平臺， 且僅限于肝實質(zhì)細胞。 因此本實驗設(shè)計納米微囊一報告基因復合體，體內(nèi)外轉(zhuǎn)染 大鼠肝細胞，探索其應(yīng)用于臨床肝靶向基因治療可行性。本 試驗分別利用納米微囊(Nanosphere)包裹Lueiferase報告 基因，作為基因治療的肝靶向載體，以提高肝靶向載體的表達 效價，并對合成的載體進行了體內(nèi)外的初步生物評價。 目的:探討納米微囊載體應(yīng)用于大鼠體外及體內(nèi)基因治療的 可行性，安全性、轉(zhuǎn)基因表達水平、轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)移方法并 與質(zhì)粒DNA進行比較。方法:以熒光素酶 第四軍醫(yī)大學博士學位論文 (lueiferase，VR1255)、綠色熒光蛋白(EGFP)為目的基因， 分別利用納米微囊PEI(聚己烯亞胺)，Chitosan(殼聚糖) 自組裝成納米微囊復合體，檢測其物理化學特性，體外轉(zhuǎn)染 肝癌細胞系HepGZ，Hep3B，Huh一7及原代大鼠肝細胞 (Hepatoeyte)，Kupffer細胞，內(nèi)皮細胞，轉(zhuǎn)染45小時后檢 測細胞轉(zhuǎn)基因表達水平，流式細胞儀檢測綠色熒光蛋白表達 轉(zhuǎn)染效率，MTT法檢測對轉(zhuǎn)基因細胞的毒性。體內(nèi)通過門靜脈、 膽管及尾靜脈灌注，檢測3、7、14天大鼠肝臟轉(zhuǎn)基因表達水 平，不同肝葉轉(zhuǎn)基因表達分布，不同組織器官的轉(zhuǎn)基因表達 水平;肝功能檢測納米微囊復合體對肝細胞的毒性;流式細 胞儀檢測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率;膽管灌注納米微囊包裹Cys標記的 質(zhì)粒DNA，通過共聚焦顯微鏡觀察納米微囊復合體在體內(nèi)的分 布，及細胞特異性內(nèi)吞，PCR及RT一PCR，檢測一月后的轉(zhuǎn)基 因大鼠DNA及RNA的表達水平。應(yīng)用特異性KC清除劑如脂質(zhì) 體包裹的二氯亞甲基二磷酸鹽及氯化禮(gadolinium ehloride，GdC13)選擇性去除Kupffer細胞，膽管灌注轉(zhuǎn)基因， 檢測3、7、14天大鼠肝臟轉(zhuǎn)基因表達水平，不同肝葉轉(zhuǎn)基因 表達分布，，不同組織器官的轉(zhuǎn)基因表達水平。結(jié)果:納米微 囊載體DNA復合物大小約為1 00~220n。，表面電荷十22.6mV， 而DNA包裹率為99%o在大鼠血清及膽汁中比較質(zhì)粒DNA具有 較好的穩(wěn)定性，PEI一DNA復合物較Chitosan一DNA復合物抗降 解能力強。體外轉(zhuǎn)染證明:多種細胞系及原代細胞轉(zhuǎn)基因表 達水平PE工一DNA約為Chitosan一DNA的10倍，體內(nèi):在三種 轉(zhuǎn)基因方法中，膽管灌注組是最優(yōu)的選擇，同組比較 Chitosan一DNA3天的轉(zhuǎn)基因表達水平高于PEI一DNA的17倍， 是背景的500倍，其它主要器官未發(fā)現(xiàn)有明顯轉(zhuǎn)基因表達水 平;流式細胞儀顯示Chi tosan一DNA轉(zhuǎn)染效率為4.8%士 第四軍醫(yī)大學博士學位論文 1.2，PEI一DNA為1.8%士0.9，免疫熒光顯示納米微囊載體DNA 復合物圍繞匯管區(qū)分布，共聚焦顯微鏡顯示肝細胞特異性內(nèi) 吞納米微囊，僅有少數(shù)Kupffer細胞內(nèi)吞PEI一DNA，PcR及 RT一PCR顯示PEI一DNA、Chitosan一DNA肝組織中DNA表達水平 至少可維持4周，而同一時間點卻無mRNA表達水平。選擇性 去除Kupffer細胞，PEI一DNA組轉(zhuǎn)基因表達水平增加了14510 倍，Chitosan一DNA組轉(zhuǎn)基因表達水平增加了100倍，質(zhì)粒DNA 增加了2020倍，轉(zhuǎn)基因表達水平3天時為PEI一DNA Chitosan一DNA質(zhì)粒DNA。結(jié)論:我們的研究表明:納米微 囊肝靶向的基因表達可
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用MEM洗兩遍后，將細胞懸液加至三層梯度液密度由下至上依次為心20000r/min，30min(20)。輕層之間細胞，此為貯脂細胞，1.0Kupffer細胞，兩種細胞用M(1一5)X105/mL接種于50ml培養(yǎng)及活力鑒定。培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞24h液1次。

納米粒子的電鏡觀察
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【引證文獻】

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 喬慶;人類補體調(diào)節(jié)因子殼聚糖納米微囊混合物體外及體內(nèi)的初步實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學;2006年

本文編號：2702445