發(fā)布時(shí)間：2020-06-07 10:51

【摘要】： 早胚發(fā)育促進(jìn)因子-1(Development Promoting Factor-l，DPF-1，一種兔輸卵管蛋白)基因(GenBank 登錄號(hào)：AF347052)由本實(shí)驗(yàn)室先前從兔輸卵管粘膜上皮細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選獲得。DPF-1與其他物種的輸卵管糖蛋白具有相當(dāng)高的同源性，尤其是靠氨基端約400 aa．序列非常保守，同源性高達(dá)80％左右，并均含有一個(gè)幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，但不具幾丁質(zhì)酶活性。DPF-1的等電點(diǎn)為7.2-8.1。利用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GST)融合表達(dá)系統(tǒng)，分別表達(dá)、純化了全長(zhǎng)DPF-1(GST-DPF-1)、氨基端DPF-1(GST-NTP-DPF-1，不包括信號(hào)肽，14-380 aa．)和羧基端DPF-1(GST-CTP-DPF-1，381-454 aa．)，并制備了相應(yīng)的抗血清；體外實(shí)驗(yàn)初步表明，抗CTP-DPF-1抗體能阻斷培養(yǎng)于兔輸卵管條件培液中的小鼠早胚發(fā)育。本課題在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)輸卵管表達(dá)的DPF-1進(jìn)行了定位，并就DPF-1的早胚發(fā)育促進(jìn)功能進(jìn)行了分析；體外表達(dá)DPF-1并觀察其在卵母細(xì)胞上的分布；克隆人輸卵管蛋白基因并進(jìn)行了體外表達(dá)分析。 輸卵管蛋白的表達(dá)受卵巢激素的控制，主要在排卵前期大量表達(dá)。取發(fā)情期兔輸卵管進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果表明兔DPF-1表達(dá)于輸卵管壺腹部和峽部的粘膜上皮細(xì)胞，且峽部表達(dá)量較高。Western Blotting表明，抗GST-CTP-DPF-1抗體能識(shí)別小鼠輸卵管表達(dá)的約50 KD蛋白；用抗GST-CTP-DPF-1抗體進(jìn)行免疫組化分析，在小鼠輸卵管傘部和峽部粘膜上皮細(xì)胞顯示陽(yáng)性反應(yīng)。 添加GST-CTP-DPF-1于M16培液中，可以顯著提高受精卵發(fā)育至囊胚的比率�？笹ST-CTP-DPF-1的抗血清對(duì)取自輸卵管內(nèi)的小鼠受精卵的進(jìn)一步發(fā)育具有抑制作用�！爸泻汀睂�(shí)驗(yàn)表明，GST-CTP-DPF-1可以消除其抗血清對(duì)小鼠受精卵發(fā)育的抑制作用。間接免疫熒光顯示，培養(yǎng)于兔輸卵管上皮細(xì)胞條件培液中的早胚細(xì)胞質(zhì)膜表面大量結(jié)合兔輸卵管蛋白。這可能暗示，DPF-1促進(jìn)早胚發(fā)育的機(jī)制是通過(guò)直接與胚胎結(jié)合而發(fā)揮作用。 為進(jìn)一步明確兔DPF-1在卵母細(xì)胞／早胚中的分布，將兔輸卵管蛋白(DPF-1)基因連結(jié)于綠色熒光蛋白(EGFP)基因的5’端，構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒(pEGFP-N1／DPF-1)，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)分泌融合蛋白EGFP-DPF-1的HeLa細(xì)胞株。該融合蛋白的表觀分子量達(dá)120 KD，提示表達(dá)的蛋白經(jīng)翻譯后修飾。取兔卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞復(fù)合物(COC)、去除卵丘細(xì)胞后的卵或輸卵管內(nèi)的卵母細(xì)胞，與該株細(xì)胞共培養(yǎng)或培養(yǎng)于該株細(xì)胞條件培液中，觀察到兔輸卵管蛋白在兔卵母細(xì)胞上的分布實(shí)況。結(jié)果顯示DPF-1大量結(jié)合于卵 摘 要（ABSTRACT） ＠ 一 �。篒糾1胞透明帶，先結(jié)合于透明帶內(nèi)層，然后糾叫寺在內(nèi)層多外層少的分令狀態(tài)上； h。如母細(xì)胞質(zhì)映表面則與＞點(diǎn)狀均勻分布。＊＊卜1在卵卅糾廠見(jiàn)上的分小不受其周日前 W！村糾＊包的m【什1，l十顆粒細(xì)胞＿廣未見(jiàn)有DP卜1 纖3合的痕跡。首次在體外揭示真 性糾］J］以往達(dá)分泌的輸卵社‘蛋！引能與印母細(xì)胞纖i合，并直接觀察到共j合的動(dòng)態(tài)過(guò) 程。為進(jìn)一步深入分析輸卵管蛋白的功能提供了線索。 為了能通過(guò)比較分析揭示輸卵管蛋白的通性和作用機(jī)制，我們以 ［a一犯PNCTP標(biāo)記兔DPF1全長(zhǎng)cDNA序列為探針，從本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的人輸卵 管粘膜上皮細(xì)胞 cDNA文庫(kù)篩選人輸卵管蛋白基因，獲得 2條編碼區(qū)相差匕 AA 的人輸卵管蛋白全長(zhǎng)cDNA序列。編碼區(qū)較長(zhǎng)的序列Q265 hp）所演繹的氨基 酸在校基端多出一個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列：較短的全長(zhǎng)序列問(wèn)262如人是目前所克隆 的最完整的人輸卵管蛋白基因，在GenBank的登錄號(hào)為AY189737。同時(shí)獲得一 ．。、＿…。。，＿．．t－＿。＿＾，＿＿�！撸摺＃�，＿。。、．＿＿．＿＿。＿．。，、．L．＿＿ 條 0．6 kb的短）宇列，與全長(zhǎng)）字列和比存在差異剪接。對(duì) AY189737基因進(jìn)行了 J本列分析，演繹的氨基酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)演繹的氨基酸的等 iii點(diǎn)及理論分子量，，翻譯后修飾及修飾位點(diǎn)。 將AYI 89737基因f．G入PE（｝FP－NI 真核表達(dá)載體，構(gòu)建表達(dá)人輸卵管蛋白 （hoviductin）一綠色熒光蛋白（EGFP）的重組質(zhì)粒 pEGFP－NI／hoviductin，轉(zhuǎn)染 fleLa細(xì)胞。借助熒光分光光度計(jì)估量條件培液中的EGFP－h(huán)oviductin。細(xì)胞條件 培液中的熒光蛋白融合的人輸卵管蛋白能結(jié)合到去透明帶的大鼠裸卵質(zhì)膜外表 面。 對(duì)人輸卵管蛋白和小鼠輸卵管蛋白進(jìn)行了同源性比較，將人輸卵管蛋白分 為高保守區(qū)、中等保守區(qū)和非保守區(qū)，并據(jù)此構(gòu)建了高保守區(qū)和中等保守區(qū)的溫 ＠度誘導(dǎo)原核表達(dá)載體。上述的研究工作，均為進(jìn)一步深入分析包括兔和人輸卵管 蛋白在內(nèi)的通性和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

BlueseriPtllSK/1.9kbDpF一1經(jīng)NotEcoRI酶切后的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析。道一:1kbLadder;道2一4:重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。圖21%瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增的DPF一l編片段。泳道z:1kbLadder，泳道2、3:PCR擴(kuò)增產(chǎn)AgaroseeleetroPhoresisanalysisofdigestedPBlueseriPtll/1.9kbDPF一1Notl/EeoR1.el，1kbladder;eZ一4，ThereeombinantPlasmidestedbyEeoRI/BamH1.Fig.21%AgaroseeleetroPhoranalysisoftheDfragmenteodingDPamPlifiedbyPCR.Linel，1kbLadder;LineZ&3，TheProduets.P一NI瓜PF一1的構(gòu)建EGFp一1/DpF一1構(gòu)建的策略如簡(jiǎn)圖3。PeR擴(kuò)增的1.4kbnNAP一NI分別經(jīng)EeoRI/BamHI雙酶切(如圖4)、純化及T4DNA一。，

得三個(gè)大量增殖的克隆，它們分別被命名為Bl沮eL留eGFP一DPF一1、BS/HeLa/eGFP一DPF一1和CS/HeLa/eGFP一DPF一l，簡(jiǎn)稱為BI、BS和CS。通過(guò)激光共聚焦攝影(圖6)，顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)合成大量綠色熒光蛋白，并明顯可見(jiàn)帶熒光的蛋白顆粒，細(xì)胞核區(qū)未觀察到熒光。各克隆細(xì)胞傳代5次后，經(jīng)RT一PCR鑒定，BS和CS細(xì)胞株總RNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物與重組質(zhì)粒pEGFP一Nl/DPF一1所含插入片段大小一致，同時(shí)從Bl、BS和CS均擴(kuò)增出一條較小的片段(圖7)。對(duì)BS克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清液的WestemBlorting分析顯示，抗該綠色熒光蛋白的抗體識(shí)別rEGFP，并在轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清液中特異地識(shí)別出一條分子量約為120
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R346

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 顏桂軍;早胚發(fā)育促進(jìn)因子-1作用靶分子的篩選大鼠卵母細(xì)胞能在聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)中成批成熟[D];復(fù)旦大學(xué);2005年

本文編號(hào)：2701306