【摘要】：背景 Thl7作為新發(fā)現(xiàn)的一類輔助性T細(xì)胞亞群,不僅作用于清除胞外病原體,而且參與自身免疫及炎性疾病,其效應(yīng)主要通過產(chǎn)生IL-17實現(xiàn)。Th17高表達趨化因子受體CCR6,與其唯一的高特異性配體CCL20趨化因子成對,介導(dǎo)了Th17的募集。研究發(fā)現(xiàn),腎臟組織中CCL20主要由腎小管間質(zhì)的浸潤細(xì)胞以及腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生。此外有文獻報道IL-17可刺激氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生CCL20。因此,本研究推測：IL-17作為一種炎癥介質(zhì)可能刺激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子CCL20,從而提示腎小管上皮細(xì)胞除履行自身非免疫細(xì)胞功能外,在炎癥狀態(tài)下尚具備招募Th17的潛能。 目的 本研究擬探討IL-17作為一種炎癥介質(zhì)是否可以刺激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子CCL20。 方法 1.細(xì)胞培養(yǎng) 用完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的1:1DMEM/F12培養(yǎng)液)常規(guī)培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)。 2.免疫細(xì)胞化學(xué) HK-2爬片經(jīng)處理后以特異性一抗(E-cad,CK-18)孵育,對照組使用PBS代替一抗,后經(jīng)二抗作用,DAB顯色。 3.IL-17處理 隨機分組,用梯度濃度(0,1,10,100ng/mL)的IL-17刺激HK-2,以研究劑量效應(yīng)關(guān)系,分別于24h收樣行RT-PCR檢測,48h收樣行ELISA檢測；隨機分組,以10ng/mL IL-17刺激HK-2于不同時間(6,12,24,48h)終止處理,以研究時間效應(yīng)關(guān)系。 4. RT-PCR分析 用TRIzol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行分析。mRNA相對表達量通過2-△△C表示。每組實驗均至少重復(fù)3次。 5.ELISA檢測 用ELISA檢測CCL20的分泌,得到OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程以計算CCL20濃度。每組實驗均至少重復(fù)3次。 6.統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗后,采用單因素／ANOVA用于判定顯著性差異,P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1.與對照組相比,E-cad和CK18在HK-2細(xì)胞中表達陽性。 2.與對照組相比,IL-17顯著促進CCL20的mRNA表達和蛋白分泌(P0.05),并且呈劑量和時間依賴性。 結(jié)論 IL-17作為一種炎癥介質(zhì)可刺激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子CCL20,從而提示腎小管上皮細(xì)胞除履行自身非免疫細(xì)胞功能外,在炎癥狀態(tài)下尚具備招募Thl7的潛能。
【圖文】：

根據(jù)IL-17處理的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)的實驗設(shè)計以及預(yù)實驗結(jié)果，分組如下。見圖2-1。Dose-depentdent / \ Time-depentdenteffects l||PW|^s^ effects. S —、V——Gene level Protein level圖2-1實驗設(shè)計方案1. IL-17剌激CCL20劑量-效應(yīng)關(guān)系對照組（含血清DMEM/F12培基）1 ng/mL IL-17 組（含血清 DMEM/F12 培基+IL-171 ng/mL)1 Ong/mL IL-17 組（含血清 DMEM/F 12 培基+IL-171 Ong/mL)11

士學(xué)位論文 第二章趨化因子CCL20在IL-17刺激HK-2細(xì)胞時的表達變化1.2.4.4.結(jié)果分析選取GAPDH為內(nèi)參，將所得目的基因的CT值與內(nèi)參進行比較得出ACT，與對照組比較得出AACT值，用2-AACT法進行計算得出RQ值，即目的基因相對表達量，，每組實驗均至少重復(fù)3次。其中擴增曲線見圖2-2。Amplification Plot
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392.12

【參考文獻】

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1 董光富,葉任高,史偉,劉雙信,汪濤,陽曉,楊念生,余學(xué)清;IL-17 induces autoantibody overproduction and peripheral blood mononuclear cell overexpression of IL-6 in lupus nephritis patients[J];Chinese Medical Journal;2003年04期

本文編號：2701008