【摘要】： 乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)是由蚊蟲傳播的引起人類或動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病毒性疾病。在我國，JE每年的發(fā)病例數(shù)2～3萬，其中約10％的患者死亡，且約15％的生存者有嚴(yán)重的神經(jīng)后遺癥。在亞洲，乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是病毒性腦炎的最主要病因。JEV依然嚴(yán)重威脅人類健康。由于JE病死率高，后遺癥較重；滅活疫苗缺乏長效免疫，必須多次加強接種，費用較高，且有可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)；減毒活疫苗有毒力回復(fù)的潛在危險使其未能被國外接受，因此，新型JE疫苗的研制仍倍受關(guān)注。 本教研室曾構(gòu)建了3種重組JE疫苗：(1)重組桿狀病毒在昆蟲細胞Sf9中表達的攜帶JEV E蛋白的HIV-1 gag病毒樣顆粒(VLPs)，(2)在果蠅細胞S2中表達的含JEV E蛋白的胞外顆粒(EPs)以及(3)以真核表達載體pVAX1為基礎(chǔ)的含JEV PrM／E的DNA疫苗(pV／JE)。我們用小鼠模型比較評價以上3種疫苗誘發(fā)動物產(chǎn)生抗JEV細胞和體液免疫水平以及動物保護效果。BALB／c小鼠經(jīng)2次接種疫苗后，測定其病毒特異性的CTL 第。軍醫(yī)人舍傅士研宛哇含位伶上 活性、結(jié)合抗體、中和抗體及幾V攻擊保護實驗。結(jié)果表明各新型疫苗 組的CTL活性為33％～56％，滅活疫苗組為22％，而載體和PBS對照組的 CTL活性分別為17％和18％。一次免疫后，實驗組小鼠血清結(jié)合抗體陽轉(zhuǎn) 率為90％。除DNA疫苗組外，各組小鼠的二次免疫血清抗體效價高于一次 免疫的抗體效價（P＜0．05）。且以 VLPS ］Jl佐劑組小鼠血清抗體效價最高， EpS加佐劑組次之，均高于 pV／JE組和滅活疫苗組（P＜0．05）。以 JEV攻 擊小鼠后，實驗組小鼠均無癥狀并全部存活。而載體PVAXI和P13S對照 組各死亡3只，且對照組存活的小鼠均出現(xiàn)病毒性腦炎的癥狀。 我們還用8從B八乳鼠評價0M疫苗對乳鼠的保護效果。2次接種mA 疫苗后，DNA疫苗組的叮L活性為 37．5％，而載體和 PBS對照組的叮I�；� 性分別為 18％和 8．5％。二次免疫后 DNA疫苗組的免疫熒光抗體滴度為 1：28．3（幾何平均效價），抗體陽轉(zhuǎn)率為孤％（8八0）：混合血清的中和抗 體效價為1：40。以JEV攻擊后，DNA疫苗組獲得75％（6侶）的保護率，而 對照組小鼠全部死亡。以上結(jié)果表明H種新型疫苗可以正確表達JliV的h 蛋白表位，可誘發(fā)免疫小鼠產(chǎn)生抗幾V的中和抗體并有保護性作用，這些 結(jié)果為JEV新型疫苗的研究提供重要的理論和實驗依據(jù)。 山于VLPS制備較繁雜，而且應(yīng)用上可能有一定的危險性；D＼A疫茁 的安全性問題目前還存在爭議；果蠅細胞表達的EpS含量不夠高。近年 建立的巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)具有糖基化適中、內(nèi)源性蛋白分泌少、 營養(yǎng)要求低、生長密度高等優(yōu)點，己廣泛應(yīng)用于包括多種病毒抗原的外 源蛋白的表達。為了分析巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)表達JEV E蛋白的可行性， 找們構(gòu)建了 JEV E蛋白的真核表達載體并首次在畢赤酵母中表達。R”rl。CI｛ 擴增JEV E蛋白基因，克隆入真核表達載體PPICgK，并進行序列分析。 表達質(zhì)粒經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)化酵母 SMD 68。用 MD平板篩選重組子、G4篩 選高拷貝轉(zhuǎn)化子，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達后，SDS－I＞AGE和蛋白印跡分析表達產(chǎn) 4 ＄。fkkq4＋Rttq4deA 物。由于糖基化不同，結(jié)果顯示所表達產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量約為 113 ti 78 kD，表達量約為50 mg／L。表達產(chǎn)物免疫動物后可產(chǎn)生中和抗體。我 們首次在巴斯德比赤酵母中成功地表達了 JEV E蛋白，為制備基因工稚 重組疫苗打下基礎(chǔ)。 山于目前治療幾無特效藥物，可以用高滴度 JEV InAb快速中和病人 血清中的病毒，降低死亡率和減輕后遺癥的并發(fā)。但JEV mAb不能做為 常規(guī)藥物使用，必須確診為JE后才能使用，所以早期確診對該病的治療 起重要的作用。檢測病人血清中 IEV gM抗體是重要的實驗室診斷方法。 出于JEV抗原制備過程的繁瑣、潛在的危險性及缺少標(biāo)準(zhǔn)化，因此，基 因工程表達的JEV E蛋白有望成為重要的實驗室診斷抗原；非糖基化的 JEV E蛋白能否誘發(fā)免疫動物產(chǎn)生中和抗體和保護活性，報道不一，有必 要進一步研究闡明。為了分析原核表達E蛋白的生物學(xué)特性，建立簡便、 快速的實驗室診斷方法，我們構(gòu)建了 JEV E蛋白的原核表達載體并在大 腸桿菌中表達。將 JEV E蛋白基因不同片段，克隆入大腸桿菌川 109構(gòu)洼 原核表達載體 pET《8a，重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌隊 “D3人經(jīng) l廠fG 誘導(dǎo)表達后，SDS－PAGE和蛋白免疫印跡分析表達產(chǎn)物。所表達的截短的 ［｛蛋白（EAB、EA、EB）的分子量分別約為 52、36、20 kD，表達量約占菌 體總蛋白的 20～35％。ELISA結(jié)果表明，2I14和 2F2 mAb可以識別 E蛋臼 ＼端片段u＊，說明 JEV E蛋白 N端也含有中和表位。表達產(chǎn)物免疫動 物可誘發(fā)中和抗體的產(chǎn)生。表達的E蛋白用于ELISA捕捉法檢測5份兒 hH人血清 JEV gM抗體，結(jié)果為全部陽性。、IEV E蛋白在大腸桿菌中的成 功表達，為制備JE實驗室診斷抗原以及分析日蛋白基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān) 系提供了條件。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R392

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本文編號：2700554