【摘要】： 乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)是由蚊蟲傳播的引起人類或動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病毒性疾病。在我國(guó)，JE每年的發(fā)病例數(shù)2～3萬(wàn)，其中約10％的患者死亡，且約15％的生存者有嚴(yán)重的神經(jīng)后遺癥。在亞洲，乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是病毒性腦炎的最主要病因。JEV依然嚴(yán)重威脅人類健康。由于JE病死率高，后遺癥較重；滅活疫苗缺乏長(zhǎng)效免疫，必須多次加強(qiáng)接種，費(fèi)用較高，且有可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)；減毒活疫苗有毒力回復(fù)的潛在危險(xiǎn)使其未能被國(guó)外接受，因此，新型JE疫苗的研制仍倍受關(guān)注。 本教研室曾構(gòu)建了3種重組JE疫苗：(1)重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)的攜帶JEV E蛋白的HIV-1 gag病毒樣顆粒(VLPs)，(2)在果蠅細(xì)胞S2中表達(dá)的含JEV E蛋白的胞外顆粒(EPs)以及(3)以真核表達(dá)載體pVAX1為基礎(chǔ)的含JEV PrM／E的DNA疫苗(pV／JE)。我們用小鼠模型比較評(píng)價(jià)以上3種疫苗誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生抗JEV細(xì)胞和體液免疫水平以及動(dòng)物保護(hù)效果。BALB／c小鼠經(jīng)2次接種疫苗后，測(cè)定其病毒特異性的CTL 第。軍醫(yī)人舍傅士研宛哇含位伶上 活性、結(jié)合抗體、中和抗體及幾V攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明各新型疫苗 組的CTL活性為33％～56％，滅活疫苗組為22％，而載體和PBS對(duì)照組的 CTL活性分別為17％和18％。一次免疫后，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清結(jié)合抗體陽(yáng)轉(zhuǎn) 率為90％。除DNA疫苗組外，各組小鼠的二次免疫血清抗體效價(jià)高于一次 免疫的抗體效價(jià)（P＜0．05）。且以 VLPS ］Jl佐劑組小鼠血清抗體效價(jià)最高， EpS加佐劑組次之，均高于 pV／JE組和滅活疫苗組（P＜0．05）。以 JEV攻 擊小鼠后，實(shí)驗(yàn)組小鼠均無癥狀并全部存活。而載體PVAXI和P13S對(duì)照 組各死亡3只，且對(duì)照組存活的小鼠均出現(xiàn)病毒性腦炎的癥狀。 我們還用8從B八乳鼠評(píng)價(jià)0M疫苗對(duì)乳鼠的保護(hù)效果。2次接種mA 疫苗后，DNA疫苗組的叮L活性為 37．5％，而載體和 PBS對(duì)照組的叮I。活 性分別為 18％和 8．5％。二次免疫后 DNA疫苗組的免疫熒光抗體滴度為 1：28．3（幾何平均效價(jià)），抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率為孤％（8八0）：混合血清的中和抗 體效價(jià)為1：40。以JEV攻擊后，DNA疫苗組獲得75％（6侶）的保護(hù)率，而 對(duì)照組小鼠全部死亡。以上結(jié)果表明H種新型疫苗可以正確表達(dá)JliV的h 蛋白表位，可誘發(fā)免疫小鼠產(chǎn)生抗幾V的中和抗體并有保護(hù)性作用，這些 結(jié)果為JEV新型疫苗的研究提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 山于VLPS制備較繁雜，而且應(yīng)用上可能有一定的危險(xiǎn)性；D＼A疫茁 的安全性問題目前還存在爭(zhēng)議；果蠅細(xì)胞表達(dá)的EpS含量不夠高。近年 建立的巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有糖基化適中、內(nèi)源性蛋白分泌少、 營(yíng)養(yǎng)要求低、生長(zhǎng)密度高等優(yōu)點(diǎn)，己廣泛應(yīng)用于包括多種病毒抗原的外 源蛋白的表達(dá)。為了分析巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)JEV E蛋白的可行性， 找們構(gòu)建了 JEV E蛋白的真核表達(dá)載體并首次在畢赤酵母中表達(dá)。R”rl。CI｛ 擴(kuò)增JEV E蛋白基因，克隆入真核表達(dá)載體PPICgK，并進(jìn)行序列分析。 表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)化酵母 SMD 68。用 MD平板篩選重組子、G4篩 選高拷貝轉(zhuǎn)化子，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS－I＞AGE和蛋白印跡分析表達(dá)產(chǎn) 4 ＄。fkkq4＋Rttq4deA 物。由于糖基化不同，結(jié)果顯示所表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量約為 113 ti 78 kD，表達(dá)量約為50 mg／L。表達(dá)產(chǎn)物免疫動(dòng)物后可產(chǎn)生中和抗體。我 們首次在巴斯德比赤酵母中成功地表達(dá)了 JEV E蛋白，為制備基因工稚 重組疫苗打下基礎(chǔ)。 山于目前治療幾無特效藥物，可以用高滴度 JEV InAb快速中和病人 血清中的病毒，降低死亡率和減輕后遺癥的并發(fā)。但JEV mAb不能做為 常規(guī)藥物使用，必須確診為JE后才能使用，所以早期確診對(duì)該病的治療 起重要的作用。檢測(cè)病人血清中 IEV gM抗體是重要的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。 出于JEV抗原制備過程的繁瑣、潛在的危險(xiǎn)性及缺少標(biāo)準(zhǔn)化，因此，基 因工程表達(dá)的JEV E蛋白有望成為重要的實(shí)驗(yàn)室診斷抗原；非糖基化的 JEV E蛋白能否誘發(fā)免疫動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體和保護(hù)活性，報(bào)道不一，有必 要進(jìn)一步研究闡明。為了分析原核表達(dá)E蛋白的生物學(xué)特性，建立簡(jiǎn)便、 快速的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，我們構(gòu)建了 JEV E蛋白的原核表達(dá)載體并在大 腸桿菌中表達(dá)。將 JEV E蛋白基因不同片段，克隆入大腸桿菌川 109構(gòu)洼 原核表達(dá)載體 pET《8a，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌隊(duì) “D3人經(jīng) l廠fG 誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS－PAGE和蛋白免疫印跡分析表達(dá)產(chǎn)物。所表達(dá)的截短的 ［｛蛋白（EAB、EA、EB）的分子量分別約為 52、36、20 kD，表達(dá)量約占菌 體總蛋白的 20～35％。ELISA結(jié)果表明，2I14和 2F2 mAb可以識(shí)別 E蛋臼 ＼端片段u＊，說明 JEV E蛋白 N端也含有中和表位。表達(dá)產(chǎn)物免疫動(dòng) 物可誘發(fā)中和抗體的產(chǎn)生。表達(dá)的E蛋白用于ELISA捕捉法檢測(cè)5份兒 hH人血清 JEV gM抗體，結(jié)果為全部陽(yáng)性。、IEV E蛋白在大腸桿菌中的成 功表達(dá)，為制備JE實(shí)驗(yàn)室診斷抗原以及分析日蛋白基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān) 系提供了條件。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2700554