發(fā)布時(shí)間：2020-06-07 00:10

【摘要】：鼠疫是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的烈性自然疫源性傳染病。歷史上曾發(fā)生過(guò)三次鼠疫大流行，導(dǎo)致至少1.6億人死亡。鼠疫的致病病原體為鼠疫耶爾森菌(Y.pestis)，屬于腸桿菌科(Enterobacteraceae)耶爾森菌屬(Yersinia)，該屬現(xiàn)包括11個(gè)菌種，除鼠疫耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌(Y.pseudotuberculosis)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Y.enterocolitica)對(duì)人致病外，其余8個(gè)菌種只對(duì)動(dòng)物致病。 鼠疫主要經(jīng)鼠蚤叮咬而傳播，傳染性強(qiáng)，病死率高，呈世界性分布，危害極大。近年來(lái)，全世界每年都有幾千例病例報(bào)告，因此，2000年世界衛(wèi)生組織將鼠疫列為重新抬頭的傳染病。1994年印度古吉拉特邦蘇拉特市爆發(fā)鼠疫流行表明，即使是在現(xiàn)代公共衛(wèi)生條件下，鼠疫仍有可能侵入大城市，造成嚴(yán)重的爆發(fā)流行。此外，鼠疫耶爾森菌還是傳統(tǒng)的重要生物戰(zhàn)劑，是國(guó)際恐怖分子可能用于制造生物恐怖的首選微生物之一。長(zhǎng)期以來(lái)人們一直致力于鼠疫疫苗的研發(fā)，以對(duì)付這種自古以來(lái)就令人生畏的疾病。 當(dāng)今世界曾經(jīng)應(yīng)用于人體免疫的鼠疫疫苗大體上可分為死菌苗、活菌苗兩大類(lèi)。最初的鼠疫死菌苗出自鼠疫正在肆虐的印度(1897)，而在越南戰(zhàn)爭(zhēng)(1961-1971)中得到較為廣泛應(yīng)用的鼠疫死菌苗為美軍的USP疫苗。但近期的動(dòng)物學(xué)研究表明，死菌苗對(duì)肺鼠疫的保護(hù)效果較差。鼠疫減毒活菌苗出現(xiàn)于1908年，在20世紀(jì)下半葉減毒的EV76活菌苗在許多國(guó)家廣為使用。但由于EV76不是無(wú)毒株，在使用安全性方面存在許多隱患，因此許多國(guó)家已不再使用。到目前為止，尚無(wú)足夠研究數(shù)據(jù)可以評(píng)價(jià)任何一種鼠疫疫苗的有效性和安全性，而且上述疫苗還伴有嚴(yán)重的副作用。所以發(fā)展一種安全、有效的鼠疫疫苗是當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)，鼠疫疫苗的研發(fā)工作主要集中在新型減毒活疫苗株的選育和重組基因工程亞單位疫苗的研制上。 理論上講，任何暴露于免疫系統(tǒng)的細(xì)菌抗原都有可能成為候選疫苗組分，但如果應(yīng)用傳統(tǒng)的研究手段一次只能對(duì)有限的幾種抗原進(jìn)行分析，而且如果體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)這幾種抗原中沒(méi)有候選疫苗組分的話(huà)就需要重新開(kāi)始新一輪篩選，通常這又需要幾年的時(shí)間。 在基因組時(shí)代，候選疫苗組分的篩選和鑒定一般分為以下4個(gè)步驟：(1) 從基因組中選定一系列基因;(2)對(duì)選定基因進(jìn)行大規(guī)模的克隆和表達(dá); (3)對(duì)獲得的重組蛋白進(jìn)行純化;(4)體內(nèi)和體外分析，評(píng)價(jià)其免疫效果。 目的基因的篩選是疫苗研發(fā)過(guò)程中的關(guān)鍵步驟之一，通�？赡芫幋a毒力因 子、分泌性抗原、膜相關(guān)性抗原的基因可通過(guò)以下策略選定:(l)用生物 信息學(xué)軟件對(duì)全基因組序列進(jìn)行比對(duì)后選定;(2)通過(guò)蛋白質(zhì)組技術(shù)(如 二維電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù))選定;(3)通過(guò)體內(nèi)表達(dá)技術(shù)(in vivo exPression teehnolo羅，wET)，條碼標(biāo)示誘變技術(shù)(signattire一tagged mutagenesis， STM)，DNA芯片技術(shù)選定。 蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)是一種大規(guī)模、平行、快速的蛋白質(zhì)分析技術(shù)平 臺(tái)，它可以同時(shí)對(duì)幾千種蛋白質(zhì)進(jìn)行平行的分析。抗原芯片的研制，使同 時(shí)研究機(jī)體對(duì)細(xì)菌全部蛋白質(zhì)的體液免疫反應(yīng)成為可能。這為候選疫苗的 鑒定以及疾病的早期血清學(xué)診斷奠定了基礎(chǔ)。因此利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)， 通過(guò)間接FLISA法就可以對(duì)感染血清中是否存在能與純化抗原發(fā)生反應(yīng)的 組分進(jìn)行鑒定。 本研究首先運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)，并結(jié)合鼠疫耶爾森菌基因組學(xué)和比 較基因組學(xué)的初步研究結(jié)果，選擇了57個(gè)可能編碼外膜蛋白、粘附蛋白、 侵襲性蛋白和對(duì)宿主細(xì)胞毒性的基因作為擬克隆和表達(dá)的目的基因。通過(guò) PCR技術(shù)、基因克隆和表達(dá)技術(shù)將上述目的基因克隆入表達(dá)載體 PET32此L21中，獲得了47個(gè)可以在大腸桿菌中正確表達(dá)目的蛋白的重組 克隆子，其表達(dá)的目的蛋白占菌體總蛋白的30%一50%。目的蛋白經(jīng)Ni~NTA 純化試劑盒純化后純度均大于85%。這些純化的蛋白質(zhì)作為探針被固定在 玻片上制成鼠疫耶爾森菌致病相關(guān)蛋白芯片。 此芯片再與定期收集的經(jīng)鼠疫耶爾森菌免疫的動(dòng)物血清(新西蘭兔、 羊)或自然感染鼠疫動(dòng)物(狗)血清進(jìn)行FLISA反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果經(jīng)掃讀后 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。由此可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)血清樣品中鼠疫耶爾森菌致病相關(guān)蛋白 相應(yīng)抗體的平行檢測(cè)，用以比較上述動(dòng)物體內(nèi)各種鼠疫耶爾森菌致病相關(guān) 蛋白相應(yīng)抗體出現(xiàn)的速度、滴度以及持續(xù)時(shí)間的差異。同時(shí)還可以比較上 述各種致病相關(guān)蛋白在不同種屬的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中免疫性的差異。 研究結(jié)果顯示，動(dòng)物體內(nèi)針對(duì)FI，o哪A(YPo1435)，LPp(Ypo2394) 抗原的抗體反應(yīng)較強(qiáng)，沒(méi)有檢測(cè)到針對(duì)Pla，Y叩T(YPCDI.20)，TyeA (YPeD 1 .35)，vi‘(鉀eol.48)，YPoZ19o，鉀03319等抗原的抗體反應(yīng)。 一5- 除了FI，omp^(YP01435)，LPp(YPo2394)以外，YopE(YPCDI.o6)， YopK(YpCD 1 .19)，YopD(YPCDI.28)，YoPN(YPCDI.39)，YopR (YPCDI.57)，Ymt(YPMTI.74)，YP01303，YP01411，YP02945也 能刺激機(jī)體產(chǎn)生一定水平的抗體。 研究結(jié)果還表明重組蛋白Fl，o娜A(YPo 1435)，L即(鐘02394) 有可能用于鼠疫感染的血清學(xué)診斷。Y叩E(YPCD 1 .06)，Y叩K (YPCD 1 .19)，YopD(YPCD 1 .28)，YoPN(YpCDI.39)，YopR (YPCDI.57)，Ymt(Y
【圖文】：

NAM.業(yè)氏lanel:Y戮】)599，laneZ:yP01005，lane3:YP《〕1052，l助e4:YP0I205，lanes:yP01222，lane6:YP07:YP01313，Ianes:Yrol411，laneg:YP01435，lanclo:YP01860，lanell:yPOZ190，lanelZ:YP02l3:YP02506，lanel4:丫rO2905，lanels刀P03247，lan.16:YP03481，lanel7:YP03646lanels:Y尹03944圖4.PcR產(chǎn)物l%瓊脂糖凝膠電泳鑒定TA克隆子的PCR鑒定及雙酶切鑒定以白色菌落為模板能擴(kuò)增論值一致的目的基因片段，其提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后可獲得大小值一致的酶切片段。表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與PCR鑒定PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆子中含有目，即目的片段己克隆入表達(dá)載體中。重組克隆子的誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)SDS.PAGE分析，發(fā)現(xiàn)36種毒力相關(guān)基有26種能在pET32此L21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出相應(yīng)分子量大的蛋白(見(jiàn)圖5)。經(jīng)雙波長(zhǎng)薄層掃描分析，目的蛋白占菌體總蛋一45%(見(jiàn)表3)。)7.4KD66.2KD

%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖7。M18171615I41312lll098765432IM2以力b1500b400b200b:DNAM.瓜er，ane7:YR刀816，anel3:YP02945.lane!:lanes:Y峨刀302，laneZ:Yr咬洲)685，lane3:Y代閱687，1陽(yáng).4:YPO0688，】助.5:Y例刀689，l業(yè)6:Y代刀690，丫PO1387，，laneg:YP0169氏lane10:YP0170認(rèn)lanell:Y尹02796，lanelZ:YP02940.lan七14:YPO3319，lanels:YP03382，lane16:y了03877，lanel7:YP03879laneIS:YrO069812111098765432
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R346

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李蓓;鼠疫耶爾森氏菌毒力相關(guān)蛋白蛋白芯片的研制與血清抗體譜的研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

本文編號(hào)：2700496