【摘要】：凋亡對于胚胎發(fā)育具有至關(guān)重要的作用，細(xì)胞增殖和凋亡的共同作用才雕塑出了面部復(fù)雜精細(xì)的結(jié)構(gòu)。各種原因?qū)е碌牡蛲龈淖�，會干擾兩側(cè)腭突和原始腭的融合，從而引起腭裂的發(fā)生。研究證明骨形成蛋白（bone morphogenetic protein (BMP))通過調(diào)節(jié)凋亡，能夠?qū)е律项M骨和腭骨的缺損，進(jìn)而引起腭裂的發(fā)生；而其上游基因GATA-6作為與胚胎發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能引起多個(gè)胚層來源的器官發(fā)育異常。GATA-6等位基因完全被敲除的雜合子動(dòng)物無法存活，而胚胎干細(xì)胞小體（embryonic stem cell derived embryoid bodies (EBs))能夠準(zhǔn)確模擬胚胎發(fā)育早期的情況，因此是研究GATA-6與腭裂等胚胎發(fā)育異常導(dǎo)致的先天性畸形相關(guān)性的理想模型。 GATA蛋白家族，作為一組鋅指翻譯因子，對于細(xì)胞分化和胚胎器官發(fā)育具有非常重要的作用。在小鼠體內(nèi)敲除GATA-6會阻礙內(nèi)胚層的分化，并且引起外胚層的凋亡。之前的實(shí)驗(yàn)觀察到，敲除GATA-6的EB內(nèi)出現(xiàn)大量的凋亡，并且其內(nèi)胚層的分化會受到影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將正常的內(nèi)胚層細(xì)胞的移植到突變的胚胎干細(xì)胞小體能夠完全阻止細(xì)胞凋亡，并恢復(fù)外胚層極化和成腔。laminin能夠誘導(dǎo)基底膜細(xì)胞在突變胚胎干細(xì)胞小體上組裝；而laminin γ1被敲除的內(nèi)胚層細(xì)胞移植到突變胚胎干細(xì)胞小體上，由于不分泌三聚體層粘連蛋白，就不會形成基底膜，只能部分抑制凋亡。這些現(xiàn)象說明內(nèi)胚層細(xì)胞來源的基底膜和非基底膜因素都對于GATA-6依賴的細(xì)胞存活具有重要的作用。 我們的微陣列分析顯示在EB分化的過程中，BMP-2、IGF-2、TGF-β和VEGF-A的表達(dá)增加，而BMP-4，F(xiàn)GF-4，PDGF-A，PDGF-C和VEGF-C的表達(dá)減少。為了確定這些生長因子的表達(dá)在GATA-6被敲除的胚胎干細(xì)胞內(nèi)是否發(fā)生了改變，我們采用了逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和免疫印跡的方法對2天的EB進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GATA-6被敲除后，BMP-4和IGF-2的mRNA表達(dá)明顯減少，而FGF-4的mRNA表達(dá)不變。重要的是，BMP-2的mRNA在2天正常的EB內(nèi)已經(jīng)能檢測到，然而在GATA-6被敲除的EB內(nèi)則檢測不到。為了證明各種生長因子對EB凋亡的影響，我們在1天的GATA-6-/-的EB內(nèi)，使用分別使用濃度為0.1μg/ml的BMP-2, FGF-4, EGF, IGF-2,PDGF和TGF-β1分別作用24小時(shí)，并且與對照組相比，然后使用全量免疫染色，通過檢測cleaved caspase-3對凋亡進(jìn)行分析。結(jié)果顯示凋亡廣泛的出現(xiàn)在GATA-6-/-的EB的周圍細(xì)胞內(nèi)，而BMP-2的加入明顯抑制了caspase-3的激活， FGF-4, EGF和PDGF則沒有效果。將BMP-2的濃度增加到0.25μg/ml后，凋亡進(jìn)一步減少。使用IGF-2作用于突變的胚胎干細(xì)胞能夠輕微的減少caspase-3的活性，而TGF-β則表現(xiàn)出相反的作用。免疫印跡分析證明，外源性的BMP-2能夠明顯降低GATA-6被敲除的胚胎干細(xì)胞小體內(nèi)的凋亡，而IGF-2的作用比較弱。進(jìn)而我們通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（Chip）證明GATA-6與BMP-2的啟動(dòng)子直接連接，GATA-6被敲除后BMP-2在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達(dá)均減少。另外，在正常的胚胎干細(xì)胞小體內(nèi)過量表達(dá)BMP的拮抗劑noggin或者抑制BMP的受體BMPR1b， EB的內(nèi)胚層的形成會受到抑制，凋亡也會明顯增加。 GATA-6被敲除的EB內(nèi)，SMAD1/5磷酸化明顯減少。SMAD（drosophila mothers against decapentaplegic protein）磷酸化的減少能夠被外源性BMP-2逆轉(zhuǎn)。用R-SMAD抑制劑DMH1作用于GATA-6被敲除的EB，能夠誘導(dǎo)內(nèi)胚層和外胚層的細(xì)胞發(fā)生凋亡。為了進(jìn)一步確定SMAD途徑的激活是否提供了一個(gè)存活信號，我們將1天的正常EB與5μM的Akt1/2抑制劑, MAPK kinase1/2抑制劑U0126,p38抑制劑SB203580和R-SMAD磷酸化抑制劑DMH1共同培養(yǎng)了24小時(shí)，在這些抑制劑中，通過檢測caspase-3的活性，發(fā)現(xiàn)只有DMH1明顯引起了凋亡而MAP激酶和Akt的抑制劑則起不到這樣的作用。這些結(jié)果表明，BMP信號通過典型Smad通路促進(jìn)胚胎上皮細(xì)胞的存活，進(jìn)而影響組織形態(tài)發(fā)生。 總之，，GATA-6能夠通過調(diào)節(jié)內(nèi)胚層分泌BMP-2和基底膜成分在胚胎早期發(fā)育過程中抑制凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞存活，并通過SMAD1/5磷酸化這一途徑發(fā)揮作用�；啄し催^來可以誘導(dǎo)外胚層分化和成腔。GATA-6直接與BMP-2的啟動(dòng)子連接以激活BMP-2，BMP-2與基底膜的作用一致，保護(hù)外胚層避免凋亡，并且以自分泌的方式促進(jìn)內(nèi)胚層的分化。這一發(fā)現(xiàn)對于進(jìn)一步了解GATA-6、BMP-2調(diào)節(jié)的凋亡與腭裂等胚胎發(fā)育異常導(dǎo)致的畸形發(fā)生的相關(guān)性，探討這些畸形發(fā)生的機(jī)制，并探索其治療的新方法具有重要的意義。
【圖文】：

去離子水定容至 100ml。配制時(shí)，在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1 GATA-6 通過影響內(nèi)胚層和基底膜的形成調(diào)節(jié) EB 內(nèi)亡。對于第 2 天，第 3 天和第 5 天的 EB 的 GATA 翻譯因子析表明，GATA-4 和 GATA-6 在第 3 天，也就是內(nèi)胚層開始面形成時(shí)，表達(dá)明顯增加，并且于第 5 天，也就是 EB 發(fā)育囊腔（即內(nèi)胚層和柱狀上皮層（CEE）時(shí)進(jìn)一步增長（見圖

也無法形成其下方的基底膜（見圖2.2、圖 2.3）。圖 2.2：免疫熒光顯微鏡顯示， GATA- 6 在正常的內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞核 表 達(dá) 。 而 GATA6 - / - 的 EB 作 為 陰 性 對 照 。 使 用Rhodamine-phalloidin 對 F-actin 進(jìn)行染色，顯示在 5 天的正常 EB 中，actin 帶已形成，而 Gata6-/-的 EB 則沒有形成 actin 帶。Figure2.2 ： Immunofluorescence microscopy showed that GATA-6 wasexpressed in the nucleus of normal endodermal cells. Gata6-/- EBs were usedas negative controls. Rhodamine-phalloidin was used to stain F-actin to showthe formation of an actin belt in 5-day normal EBs but not Gata6-/- EBs.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R321

【參考文獻(xiàn)】

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1 柴茂洲;李承浩;何永紅;石冰;;四氯二苯對二惡英和地塞米松誘導(dǎo)小鼠腭裂及轉(zhuǎn)化生長因子-β3和受體活化樣激酶5的表達(dá)[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2010年04期

2 何葦;盧勝軍;李承浩;周京琳;蒙田;鄭謙;石冰;;地塞米松和維生素B_(12)對小鼠胚胎腭突發(fā)育早期成纖維生長因子10及其2b受體信號的影響[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2010年05期

3 李肖,官泳松,周翔平,孫龍,劉源,賀慶,富力,毛詠秋;20(R)-人參皂甙Rg3對大鼠肝癌細(xì)胞的作用[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年02期

本文編號：2699507