【摘要】：1.目的： p53基因與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),在所有惡性腫瘤中,50%以上會出現(xiàn)該基因的突變。人們普遍認為P53起到抑制細胞增殖的作用,但在肝細胞中發(fā)現(xiàn)抑制P53功能的同時也抑制了細胞增殖。提示P53對于細胞增殖具有促進作用。最近有文獻報道P53是人源性或鼠源性TGFa的轉(zhuǎn)錄起始因子,同時P53也可以激活MAPK途徑,提示P53有促進細胞增殖作用。本研究主要探索P53促進細胞增殖的機理。 2.方法： 2.1細胞提取和培養(yǎng) 雄性成年Wistar大鼠,重200～220克,飼養(yǎng)在12小時陽光12小時黑夜條件下。肝原代細胞使用改良的體外膠原酶灌注兩步分離術(shù)提取。細胞死亡由臺盼藍染色計數(shù)。細胞種植密度為20000個/cm2。無血漿培養(yǎng)液由Williams Medium E培養(yǎng)基和Dulbecco's modified Eagle's medium按等比例混合,最終葡萄糖濃度為8.4mmol/L。培養(yǎng)基中加入青霉素(67mg/L),鏈霉素(100mg/L),地塞米松(25nmol/L)和胰島素(100nmol/L)。在種植前3個小時使用5%血漿培養(yǎng)基培養(yǎng)。然后使用無血漿培養(yǎng)液培養(yǎng)在37℃,5%C02條件下。實驗使用10nmol/L的EGF刺激細胞。 2.2Western Blotting檢測蛋白 培養(yǎng)的肝原代細胞使用Tris-lysis buffer (pH7.4,含60mmol/L的Tris-HCl,10%甘油,3%的硫酸鈉(SDS), lmol/L的EDTA,0.2mmol/L的AEBSF,20μmol/L亮肽素,200U/mL的抑肽酶,65μmol/L釩酸鈉和10mmol/L的β-甘油磷酸)裂解。然后裂解液進行超聲。所有樣本的蛋白濃度使用DC protein assay檢測(Bio-Rad, Hercules, CA, USA),并調(diào)整到相同濃度,最終加入p-巰基乙醇和溴酚藍并使它們的濃度分別為5%和0.0025%。樣品煮上4分鐘并貯存于-20℃條件下。樣品蛋白進入凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜上進行隨后的分析。硝化纖維膜使用含5%牛奶的Tris-buffered saline溶液封閉,然后使用含1%牛奶的Tris-buffered saline的一抗溶液4℃孵育過夜。實驗中使用以下抗體：鼠源性的抗Cyclin E抗體和抗P53抗體,購自Cell Signalling Technology公司,兔源性的抗Cyclin D1抗體和鼠源性的抗P21抗體,購自Upstate Biotechnology公司,抗Thr202/204位點磷酸化的Erk抗體和抗CDK4抗體,購自Cell Signalling Technology公司,鼠源性抗(3-tubulin抗體,購自Sigma-Aldrich公司,購自Fitzgerald公司,兔源性抗pYl173位點磷酸化的EGF受體抗體。 沖先后,硝化纖維膜孵育二抗溶液90分鐘,二抗為HRP連接的山羊源性抗兔IgG抗體和驢源性抗鼠IgG抗體及驢源性抗綿羊性IgG抗體,購自Sigma Aldrich公司。熒光使用加強的化學熒光(ECL)法檢測。 2.3放射滲入法檢測細胞增殖 肝細胞在六孔板上如上培養(yǎng)。細胞種植后48小時加入氚標記的胸苷(1μCi/ml)。 DNA合成程度由檢測到的細胞吸收的放射性胸苷來表示。六孔板由三氯乙酸沖洗兩次,每次10分鐘。剩下的細胞由0.3ml的1mol/L KOH溶解,放射性由液體閃爍儀計數(shù)。蛋白濃度測定如上 2.4ELISA檢測TGFa濃度 收集培養(yǎng)液并根據(jù)ELISA法說明步驟檢測TGFa(靈敏度為5pg/ml)濃度。將針對TGFa膜外部分抗原決定族和整個TGFa分子抗原決定族的多克隆抗抗體固定到檢測板上(捕獲抗原),沖洗檢測板,將同量的不同組的樣品與羊抗人源性的TGFa抗體混合,然后加到檢測板上。3小時孵育后,沖洗檢測板3次后漂洗1次去除未與檢測板結(jié)合的物質(zhì)。鏈霉卵白素-過氧化物酶孵育樣本30分鐘。沖洗3次和漂洗1次后,在無光環(huán)境下發(fā)色底物鄰苯二胺孵育樣本后使用硫酸終止反應(yīng)。使用TGFa干粉和蒸餾水及緩沖液配制的250,125,and63pg/ml及其它合適濃度溶液作為標準濃度,分光光度計在490nm檢測樣本濃度。為了排除操作過程中溶液含有影響檢測的因子,同時檢測由緩沖液和操作溶液等比例混合配制的濃度為63,125,250pg/ml和其它合適濃度的標準液。所有的檢測使用相同的處理步驟。 2.5免疫熒光檢測蛋白細胞內(nèi)分布 4%甲醛溶液固定新鮮的細胞樣品10min。PBS溶液沖洗2×10min后,室溫干燥30min,待樣品表面無多余液體后加一抗至細胞表面,置于濕盒內(nèi),室溫孵育過夜。然后PBS溶液沖洗2×10min,加熒光標記二抗溶液至細胞表面,置于濕盒內(nèi),室溫孵育1小時。然后PBS溶液沖洗2×10min,室溫干燥30min,待樣品表面無多余液體后,將蓋玻片固定在載玻片表面,使用共聚焦顯微鏡進行觀察(60×油鏡)。 3結(jié)果 3.1P53與細胞增殖 1)EGF刺激細胞后激活P53功能 在培養(yǎng)液中添加EGF刺激細胞24小時或30小時后,細胞中P21的表達升高；而P53抑制劑pifithrin-α可以完全阻斷EGF誘導生成P21。上述結(jié)果表明EGF刺激細胞后可激活P53,進而促進轉(zhuǎn)錄生成P21。 2) Cyclin D的表達依賴P53激活 在培養(yǎng)液中添加EGF刺激細胞24小時和30小時后,細胞中Cyclin D的表達升高,而P53抑制劑pifithrin-α可以阻斷此一過程。結(jié)果顯示Cyclin D的生成依賴P53的激活。 3)P53與細胞增殖的劑量反應(yīng)關(guān)系 按在肝細胞EGF刺激1小時前使用P53抑制劑及抑制劑濃度分組,細胞受EGF刺激30小時后使用放射滲入法檢測各組細胞的增殖水平。結(jié)果顯示P53抑制劑pifithrin-α可以抑制EGF誘導的肝細胞增殖,pifithrin-α濃度與細胞增殖存在劑量反應(yīng)關(guān)系,當pifithrin-α濃度高至30μmol/L時,將完全抑制肝細胞的增殖。 4)P53與細胞增殖的時效關(guān)系 按加入P53抑制劑pifithrin-α到細胞培養(yǎng)液的時間點分組,EGF刺激30小時后使用放射滲入法檢測各組細胞的增殖水平。在EGF刺激細胞1小時前或第12小時使用pifithrin-α,肝細胞增殖將會完全受到抑制,而第24小時使用pifithrin-α則細胞增殖受到部分抑制。結(jié)果顯示,P53激活對細胞增殖的影響主要發(fā)生在EGF刺激細胞12小時后。 3.2P53促進細胞增殖的機制 1)細胞分泌TGFα依賴P53激活 EGF刺激肝細胞后24小時收集培養(yǎng)液,使用ELISA檢測培養(yǎng)液中TGFα的水平(以三次實驗結(jié)果的均數(shù)表示)。結(jié)果顯示在未給予EGF刺激的肝細胞培養(yǎng)液中TGFα于8pg/ml,而在EGF刺激的肝細胞培養(yǎng)液中TGFα為38.24pg/ml。而如果在給予EGF刺激前1小時應(yīng)用P53抑制劑pifithrin-α,則培養(yǎng)液中的TGFα為12.3pg/ml。所以EGF刺激細胞分泌TGFα依賴P53的激活。 2) TGFα與細胞增殖的劑量反應(yīng)關(guān)系 EGF刺激細胞30小時后使用放射滲入法檢測細胞的增殖水平。按在肝細胞EGF刺激1小時前使用中和抗體及抗體種類濃度分組,檢測各組細胞的增殖情況。結(jié)果顯示TGFα中和抗體可以抑制肝細胞增殖,而當TGFα中和抗體濃度高至0.5mg/L時,將完全抑制肝細胞的增殖。說明肝細胞自分泌的TGFα和細胞增殖存在劑量反應(yīng)關(guān)系。 分別將對照抗體和TGFα中和抗體與EGF混合溶解于100u1培養(yǎng)液中,1小時后將此混合液分別加入正常的肝細胞培養(yǎng)液中,10分鐘后使用WESTERN BLOTTING法檢測細胞的EGF受體和ERK1/2的磷酸化水平。結(jié)果顯示,TGFα中和抗體與EGF的混合液并未影響EGF受體和ERK1/2的磷酸化水平,說明TGFα中和抗體與EGF并未發(fā)生特異性的交叉反應(yīng)。 3) TGFα與細胞增殖的時效關(guān)系 在EGF刺激細胞后不同時間加入TGFα抗體中和培養(yǎng)液中細胞分泌的TGFα, EGF刺激30小時后使用放射滲入法檢測各組細胞的增殖水平。結(jié)果顯示,在EGF刺激細胞1小時前或第12小時使用TGFα中和抗體,肝細胞增殖將會完全受到抑制,而在第24小時使用TGFα中和抗體,則細胞增殖受到部分抑制。說明細胞分泌的TGFα主要在EGF刺激細胞12小時后起作用,與P53促進細胞增殖具有相同的時效關(guān)系,提示P53通過TGFα促進細胞增殖。 3.3TGFα促進細胞增殖的機制 1) TGFα促進Cyclin D表達 TGFα促進細胞增殖的作用主要發(fā)生在EGF刺激細胞12小時后,因此在EGF刺激細胞12小時后加入培養(yǎng)液TGFα中和抗體,在24小時和30小時收獲細胞。結(jié)果顯示,TGFα中和抗體抑制Cyclin D的表達,說明細胞分泌的TGFα起到促進Cyclin D表達的作用。證實了P53抑制Cyclin D的表達是通過TGFα實現(xiàn)的。 2) TGFα促進Cyclin D細胞核內(nèi)分布 Cyclin D的功能也依賴其在細胞內(nèi)的分布,當EGF刺激細胞30小時后,Cyclin D和CDK4均位于細胞核內(nèi),而如果不給予細胞EGF刺激,則Cyclin D和CDK4均位于細胞質(zhì)內(nèi)。當使用鼠源性的TGFα單克隆抗體中和培養(yǎng)液中細胞分泌的TGFα后,Cyclin D口CDK4與不給予EGF刺激細胞的情況相似,仍位于細胞質(zhì)中未進入細胞核內(nèi),說明細胞分泌的TGFα起到促進Cyclin D和CDK4細胞核內(nèi)聚集的作用。 4.結(jié)論 EGF刺激肝原代細胞后可引起P53蛋白激活,P53進入細胞核后促使TGFα基因進行轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄生成的TGFα可由細胞分泌到細胞外,TGFα可與EGFR受體結(jié)合刺激細胞,誘導Cyclin D蛋白合成和細胞核內(nèi)聚集,促進細胞增殖。
【圖文】：

按在肝細胞EGF刺激1小時前使用P53抑制劑及抑制劑濃度分組，細胞受EGF刺激30小時后使用放射滲入法檢測各組細胞的增殖水平，見圖1C和表1。結(jié)果顯示P53抑制劑pifithrin-a可以抑制EGF誘導的肝細胞增殖，pifithrin-a濃度與細胞增殖存在劑量反應(yīng)關(guān)系，當pifithrin-a濃度高至30nmol/L時，將完全抑制肝細胞的增殖。100 - I：. n na 70 h ‘1 60 ！ _ ‘ 門2 50 ‘- i T-=40 ！-30 I pi ：2010 i ‘‘■r 0 . I L_ , I I , I,、I __ 1 I Iwithout EGF EGF EGF+pif (lOu EGF+pif (20 u EGF+pif (30uraol/L) raol/L) mol/L)圖1C:P53與細胞增殖的劑量反應(yīng)關(guān)系 表1 P53與細胞增殖的劑量反應(yīng)關(guān)系 分組 均數(shù) 標準誤 95%均數(shù)范圍without EGF 31.55 2.09 27.45?35.65EGF 100.00 0.72 98.59?101.41EGF+pif (

3.結(jié)果注：肝原代細胞種植培養(yǎng)20小時后給予EGF (10 nmol/L)刺激，pifithrin-a (10|amol/L,20iamol/L, 30iamol/L)在EGF刺激1小時前加入，30小時后收集樣本。使用放射滲入檢測細胞增殖水平。根據(jù)三次獨立重復(fù)實驗得到結(jié)果（SEM;n=3)。3.1.4 P53與細胞X椫車氖斃Ч叵蛋醇尤隤53抑制劑pifithrin-a到細胞培養(yǎng)液的時間點分組，EGF刺激30時后使用放射滲入法檢測各組細胞的增殖水平，，見圖ID和表2。在EGF刺激胞1小時前或第12小時使用pifithrin-a，肝細胞增殖將會完全受到抑制，而24小時使用pifithrin-a則細胞增殖受到部分抑制。結(jié)果顯示，P53激活對細胞殖的影響主要發(fā)生在EGF刺激細胞12小時后。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：2699263