【摘要】：一．研究目的： 本研究的擬建立成熟的、功能良好的DC細(xì)胞的培養(yǎng)體系，即：DC細(xì)胞形態(tài)典型、表達(dá)特征性的CD分子、能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化、增殖、亞群分化、分泌特征性細(xì)胞因子；研究DC細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)并在納米級(jí)水平上做進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析，用熒光探針尋找DC細(xì)胞成熟標(biāo)志的CD分子(CD83、CD1a)、第二信號(hào)CD分子(CD86、CD80)和代表亞群來(lái)源的CD11c分子的表達(dá)位置，推測(cè)免疫應(yīng)答的發(fā)生部位；觀察免疫應(yīng)答時(shí)DC細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞的相互作用、形態(tài)學(xué)變化和Ca2+的動(dòng)態(tài)變化。 二、材料和方法： (一)主要試劑和設(shè)備： 1．試劑： AIM-V培養(yǎng)基、rhGM-CSF、rhIL-4、小鼠抗人FITC標(biāo)記的CD86、HLA-DR、CD11c、Lin-1、CD4、IgG2a、CD45RA、CD69、Lin-1及小鼠抗人PE標(biāo)記的CD83、CD86、CD80、CD3、CD123、CD40、CD4、CD25、CD28、CD45RO、IFN-γ和IL-4；小鼠抗人CD4-APC、CD8PE—Cy5、HLA-DR-percp、Mouse IgGl-PE和Mouse IgGl-FITC的MoAb；Annexin V-FITC／PⅠ雙染法流式細(xì)胞分析試劑盒。 2．設(shè)備： 二氧化碳電熱恒溫箱、流式細(xì)胞儀、Nikon倒置顯微鏡及相機(jī)、掃描電鏡、透射電鏡、原子力顯微鏡、共聚焦顯微鏡 (二)實(shí)驗(yàn)方法 1．對(duì)有無(wú)懸浮細(xì)胞的條件下，用含有rhGM—CSF 800~(?)／ml、IL-4 500~(?)／和TNF-α250~(?)／ml的無(wú)血清培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)DC細(xì)胞，并在光鏡下每天記錄形態(tài)學(xué)變化； 2．胞儀分析DC細(xì)胞Lin—HLA-DR+細(xì)胞群的CD83、CD1a、CD86、CD80、CD11c、CD123的表達(dá)情況； 3．胞儀分析DC細(xì)胞遞呈抗原后T細(xì)胞的CD69變化，進(jìn)而分析CD4+T細(xì)胞的CD4／CD3、CD4／CD25、CD45RO／CD45RA、CD4／CD28亞群以及CD8+T細(xì)胞的CD8／CD3、CD8／CD25、CD45RO／CD45RA、CD8／CD28亞群比例的變化情 況; 4.當(dāng)DC細(xì)胞被抑制時(shí)，用RNAase抑制RNA、核酸染料PI標(biāo)記細(xì)胞DNA， 在流式細(xì)胞儀上分析在T細(xì)胞的周期變化; 5.流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN一Y和IL一4的情況，間接 獲悉T細(xì)胞的定向分化; 6.AnnexinV一FITC/PI雙染法流式細(xì)胞分析試劑盒分析DC細(xì)胞遞呈抗 原后的凋亡情況; 掃描電鏡和透射電鏡分析DC細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，尋找其結(jié)構(gòu) 特征; 7.利用AFM在納米水平上進(jìn)一步分析DC細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)以及其與T細(xì)胞 作用方式; 8.免疫電鏡觀察CD86的表達(dá)位置; 9.利用共聚焦顯微鏡分析DC細(xì)胞的特征性CD分子的表達(dá)情況，觀察DC 細(xì)胞與T細(xì)胞的作用過(guò)程、DC細(xì)胞吞噬抗原的過(guò)程、DC細(xì)胞內(nèi)游離CaZ十 的變化過(guò)程以及DC細(xì)胞凋亡的過(guò)程 三、結(jié)果: 1.光鏡下見(jiàn)貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中(7天)逐漸長(zhǎng)出長(zhǎng)短不一樹(shù)突狀突 起，細(xì)胞形態(tài)不一;電鏡觀察到DC表面呈多層“面紗”覆蓋，有大量皺 褶，“面紗”邊緣有長(zhǎng)短不一的不規(guī)則的樹(shù)突狀突起，每個(gè)突起有多級(jí)分 枝;AFM見(jiàn)DC細(xì)胞的“面紗”狀結(jié)構(gòu)是由多級(jí)樹(shù)突狀突起相互纏繞形成 的，各個(gè)DC細(xì)胞之間的突起相互連接，構(gòu)成集落; 2.DC細(xì)胞表型在Lin--和HLA一DR+細(xì)胞群中，各CD分子表達(dá)的百分比為: CD123/54.5、CDlle/88.99、CD4O/56.65、CDla/69.36、CD86/92.57、 CDSO/70.79、CD83/85.91; 3.DC細(xì)胞遞呈抗原后T細(xì)胞的CD69明顯升高，CD4+CD69+/19.05%; CDS+CD69+/21，93%; 4.CD4+和CDS+的兩組細(xì)胞的CD3+、CD25+、CD45RO+/CD45RA+的百分率均 增高，CD28+的百分率和CD45RO一/CD45RA+的百分率均下降;CD4+/CD28- 和CDS+/CD28一的百分率亦升高; 5.DC細(xì)胞遞呈抗原后，T細(xì)胞的S期細(xì)胞的比率從0.66%增加為7.21%; 而DC的死亡率和凋亡率，，分別由0.05%和0.00%升為6.95%和4.65%; 3 6.DC細(xì)胞含有豐富的線立體、微管和微絲系統(tǒng);凋亡的DC細(xì)胞，其細(xì) 胞核染色質(zhì)固縮，內(nèi)吞體嚴(yán)重?cái)U(kuò)張，細(xì)胞膜空泡化; 7.CD86分子主要聚集于胞體特定的區(qū)域內(nèi)，突起部位表達(dá)較少，CD83和 CDla表達(dá)在細(xì)胞膜上，而CDllc則表達(dá)在細(xì)胞體部位; 8.羊抗小鼠IgG一F工TC分子隨時(shí)間不同逐漸由細(xì)胞膜分布到整個(gè)DC細(xì)胞; 9.DC細(xì)胞遞呈抗原后，CaZ+濃度升高，隨即細(xì)胞破裂。 四.結(jié)論: 1.該方法可以誘導(dǎo)出的成熟DC細(xì)胞，形態(tài)典型，而且少量懸浮細(xì)胞不影 響DC細(xì)胞的分化和成熟;“面紗”狀結(jié)構(gòu)是由多級(jí)樹(shù)突狀突起相互纏繞形 成，擴(kuò)大了DC細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，是有效捕獲抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ); 2.DC細(xì)胞多個(gè)亞群可共存生長(zhǎng)，絕大多數(shù)為MDC，而且成熟度高并表達(dá) 豐富的雙信號(hào)分子; 3.DC細(xì)胞具有吞噬功能，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞活化、增殖，具有遞呈抗原功 育旨; 4.DC細(xì)胞遞呈抗原后，在T細(xì)胞的作用下，DC細(xì)胞伴隨細(xì)胞內(nèi)CaZ十濃 度的升高走向凋亡和死亡，且凋亡為非同步性。
【圖文】：

圖13圖14三.結(jié)論:1.DC細(xì)胞的“慢”狀結(jié)構(gòu)系由樹(shù)突狀突起的多級(jí)分枝相互纏繞而成，AFM下這些“慢”狀結(jié)構(gòu)是由樹(shù)突狀突起的多級(jí)分枝有序排列形成的巨大的網(wǎng);2.多枝細(xì)小的末級(jí)突起相互纏繞形成網(wǎng)的邊緣;3.各種類(lèi)型DC之間存在著結(jié)構(gòu)上的連接;4.1個(gè)DC細(xì)胞可有多個(gè)淋巴細(xì)胞環(huán)繞接觸，而1個(gè)淋巴細(xì)胞亦可接受多個(gè)DC細(xì)胞的多部位的接觸，淋巴細(xì)胞被DC細(xì)胞的強(qiáng)大的網(wǎng)絡(luò)所捕獲;5.DC細(xì)胞的細(xì)小的突起與T淋巴細(xì)胞之間的絨毛狀連接之間存在縫隙，為近距離“接觸”(3nm)，是否屬于縫隙連接形式的信號(hào)傳遞尚不清楚。四.討論:AFM是在掃描電子顯微鏡的基礎(chǔ)上發(fā)展的新一代顯微鏡。AFM具有0.01一0.Inm的分辨率，可以直接觀測(cè)到原子水平，可以對(duì)原子、分子進(jìn)行直接操縱，在自然的大氣或液體條件下成像，是研究生物大分子表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、特別是局域結(jié)構(gòu)的理想方法。利用AFM可以獲取細(xì)胞膜和細(xì)胞器表面的結(jié)構(gòu)信息及在不同環(huán)境條件下變化，以及與這種變化相關(guān)聯(lián)的生物的生理過(guò)程的靜態(tài)信息〔34〕。現(xiàn)在全細(xì)胞的AFM成像已經(jīng)實(shí)現(xiàn)

圖2二.DC的來(lái)源及體外培養(yǎng)由于自體免疫細(xì)胞與異體樹(shù)突狀細(xì)胞之間由于存在著人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)基因型不相合會(huì)引起強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)，且受者體內(nèi)的T細(xì)胞不能識(shí)別供者樹(shù)突狀細(xì)胞上非匹配的HLA分子，無(wú)法誘導(dǎo)有效的CTL的增殖及抗腫瘤作用，因而必須是自體的樹(shù)突狀細(xì)胞才能作為腫瘤疫苗的負(fù)載體用于臨床抗腫瘤治療。目前用作瘤苗的樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)源有:骨髓、外周血和新生兒臍帶血。三.Dc疫苗的種類(lèi)目前，DC介導(dǎo)的疫苗主要有三大類(lèi):腫瘤抗原肚修飾的DC;細(xì)胞性腫瘤抗原修飾的DC;腫瘤抗原及細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染的DC，具體研究及應(yīng)用將在各具體疾病中詳細(xì)討論，現(xiàn)僅概述如下。1.腫瘤抗原膚修飾的DC動(dòng)物模型及人體臨床試驗(yàn)已證明，腫瘤抗原膚(包括合成膚)或腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原與自身或同種異體的DC共育，DC與腫瘤表位膚結(jié)合之后可激發(fā)抗腫瘤CTL有效的抗腫瘤免疫
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 范國(guó)昌,吳祖澤,王艷飛,邱兆華;人樹(shù)突狀細(xì)胞與K562細(xì)胞的融合以及體外誘導(dǎo)p210蛋白特異性CTL的研究(英文)[J];癌癥;1999年06期

2 錢(qián)一峰,厲永建,孫衛(wèi)民;樹(shù)突狀細(xì)胞與T輔助細(xì)胞分化[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));2001年03期

3 陳耀文,林玨龍,賴效瑩,梅品超;激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用[J];激光生物學(xué)報(bào);1998年02期

4 范萍,武正炎,王水,查小明,甄林林;人外周血中樹(shù)突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)、培養(yǎng)及其表面標(biāo)記的初步研究[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2002年01期

5 朱學(xué)軍,曹雪濤,雷虹,于益芝,王建莉,章衛(wèi)平,馬施華;弱酸洗脫提取的腫瘤抗原肽致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)CTL的體內(nèi)外激活效應(yīng)[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2000年02期

6 曹雪濤;樹(shù)突狀細(xì)胞與腫瘤的免疫治療和基因治療——樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞與分子生物學(xué)Keystone會(huì)議(美國(guó))簡(jiǎn)介[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;1998年02期

本文編號(hào)：2698387