【摘要】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)排空引起的通過鈣庫(kù)操控性鈣通道的鈣離子內(nèi)流在大多數(shù)興奮性細(xì)胞中也被證實(shí)為重要的鈣離子內(nèi)流途徑。而Orai1蛋白作為鈣釋放激活性鈣通道的組成亞基，廣泛表達(dá)在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中。Orai1蛋白具有多種生理功能，例如：鈣庫(kù)操控性鈣通道的組成部分、接受外來(lái)刺激的受體或蛋白相互作用的支架等。已有研究證實(shí)由鈣庫(kù)操控性鈣通道介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的分化，但是其相關(guān)機(jī)制少有研究。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)用慢病毒敲除Orai1蛋白能夠抑制PC12細(xì)胞突起形成，而且在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中，神經(jīng)元的樹突棘出現(xiàn)缺失，生長(zhǎng)錐對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的反應(yīng)消失。有趣的是，當(dāng)我們用PKC的抑制劑GF109203x預(yù)處理細(xì)胞時(shí)，敲除Orai1蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)胞分化的抑制作用會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)；鈣影像結(jié)果顯示：GF109203x能夠抑制Tg誘導(dǎo)的細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流；Western結(jié)果顯示，：GF109203x能夠抑制PC12細(xì)胞的MAPK磷酸化；生長(zhǎng)錐反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示：GF109203x能使生長(zhǎng)錐對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的反應(yīng)消失。因此，，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)Orai1蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的分化作用的影響與Rap1-MAPK和PKC信號(hào)途徑相關(guān)，并且是保持神經(jīng)細(xì)胞完整性和興奮性的必要調(diào)節(jié)因子。 因此，我們的研究中首次報(bào)道沉默Orai1對(duì)興奮性細(xì)胞PC12細(xì)胞的分化、對(duì)原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元樹突棘的形成、生長(zhǎng)錐分化均有抑制作用。Orai1蛋白功能機(jī)制的探究很有可能成為神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病研究的新靶點(diǎn)。論文共包括三部分，其主要內(nèi)容與結(jié)果如下： 一．鈣影像結(jié)果顯示沉默Orai1的效果在PC12細(xì)胞被NGF誘導(dǎo)后更明顯，而且PKC抑制劑GF109203X增強(qiáng)Orai1沉默效果 利用沉默Orai1蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)在兩種條件下進(jìn)行，通過鈣影像分析在Tg誘導(dǎo)下，SOCE的變化情況。首先，在未分化條件下，用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理對(duì)照組（shconGFx）與正常對(duì)照組（shcon）相比，Δ340/380減少了48%（p0.05）；用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理沉默Orai1蛋白組（shOGFx）與未處理沉默Orai1蛋白組（shO）相比，Δ340/380變化幅度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；未處理沉默Orai1蛋白組（shO）與正常對(duì)照組（shcon）相比，Δ340/380減少了75%（p0.001）；用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理沉默Orai1蛋白組（shOGFx）與用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理對(duì)照組（shconGFx）相比，Δ340/380減少了50%（p0.001）。接著，在100ng/ml NGF刺激下，用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理對(duì)照組（shconGFx）與正常對(duì)照組（shcon）相比，Δ340/380減少了25%（p0.05）；用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理沉默Orai1蛋白組（shOGFx）與未處理沉默Orai1蛋白組（shO）相比，Δ340/380減少了83%（p0.05）；未處理沉默Orai1蛋白組（shO）與正常對(duì)照組（shcon）相比，Δ340/380減少了70%（p0.001）；用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理沉默Orai1蛋白組（shOGFx）與用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理對(duì)照組（shconGFx）相比，Δ340/380減少了80%（p0.001）。 二．沉默Orai1抑制NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞neurite outgrowth生長(zhǎng)，降低MAPK的磷酸化和Rap-GTP活化水平；PKC抑制劑GF109203x能夠增強(qiáng)Orai1沉默的抑制功能 利用沉默Orai1蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系，同樣在不同的兩種條件下觀察細(xì)胞形態(tài)。如圖所示，在未分化條件下，shcon組細(xì)胞僅看到少量短突起，視為未分化。在100ng/ml NGF刺激下，根據(jù)分化陽(yáng)性細(xì)胞選取原則：neurite outgrowth突起長(zhǎng)度大于或等于胞體直徑則視為分化陽(yáng)性細(xì)胞。用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理對(duì)照組（shconGFx）與正常對(duì)照組（shcon）相比，細(xì)胞分化程度降低45%；用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理沉默Orai1蛋白組（shOGFx）與未處理沉默Orai1蛋白組（shO）相比，細(xì)胞分化程度降低50%。未處理沉默Orai1蛋白組（shO）與正常對(duì)照組（shcon）相比，細(xì)胞分化程度降低80%；用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理沉默Orai1蛋白組（shOGFx）與用PKC抑制劑GF109203x(GFx)預(yù)處理對(duì)照組（shconGFx）相比，細(xì)胞分化程度降低80%。 通過蛋白質(zhì)免疫印跡法分析沉默Orai1蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系中MAPK磷酸化水平和Rap1-GTP活化水平，用Tg預(yù)處理的細(xì)胞比未處理的細(xì)胞MAPK磷酸化程度增強(qiáng)，但是當(dāng)沉默細(xì)胞內(nèi)Orai1蛋白后，MAPK磷酸化程度減弱；當(dāng)所有組別細(xì)胞均用GFx預(yù)處理后，用Tg預(yù)處理的細(xì)胞比未處理的細(xì)胞MAPK磷酸化程度明顯增強(qiáng)，但是當(dāng)沉默細(xì)胞內(nèi)Orai1蛋白后，MAPK磷酸化程度明顯減弱。用Tg預(yù)處理的細(xì)胞比未處理的細(xì)胞內(nèi)Rap1-GTP水平升高，但是當(dāng)沉默細(xì)胞內(nèi)Orai1蛋白后，細(xì)胞內(nèi)Rap1-GTP水平降低；當(dāng)所有組別細(xì)胞均用GFx預(yù)處理后，用Tg預(yù)處理的細(xì)胞比未處理的細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)Rap1-GTP水平升高，但是當(dāng)沉默細(xì)胞內(nèi)Orai1蛋白后，細(xì)胞內(nèi)Rap1-GTP的水平降低。 三．大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)中光鏡觀察到沉默Orai1神經(jīng)元的軸突對(duì)NGF吸引反應(yīng)消失，通過電鏡觀察沉默Orai1神經(jīng)元的樹突棘出現(xiàn)缺失 一方面，NGF對(duì)沉默Orai1神經(jīng)元生長(zhǎng)錐的吸引反應(yīng)消失。當(dāng)用NGF刺激神經(jīng)元30分鐘后，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)錐有明顯的轉(zhuǎn)向反應(yīng)。在沉默Orai1神經(jīng)元組中我們并沒有觀察到生長(zhǎng)錐的轉(zhuǎn)向反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中生長(zhǎng)錐只有長(zhǎng)到一定長(zhǎng)度后才能觀察到明顯的轉(zhuǎn)向反應(yīng)，因而我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中只收集生長(zhǎng)長(zhǎng)度大于10μm的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 另一方面，利用包裝好的慢病毒shconRNA，shOrai1RNA感染原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，培養(yǎng)21天后觀察樹突棘密度；對(duì)照組神經(jīng)元樹突上的樹突棘密集呈小頭狀，沉默Orai1神經(jīng)元組則呈現(xiàn)出樹突棘減少，甚至出現(xiàn)光滑的樹突，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示沉默Orai1蛋白后，神經(jīng)元樹突棘密度減少50%以上。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R338

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本文編號(hào)：2697843