【摘要】：目的:建立能穩(wěn)定分泌高親和力、高特異性抗人胃泌素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,在對(duì)其親和力、特異性以及生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上,克隆抗人胃泌素單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,構(gòu)建抗人胃泌素單鏈抗體基因,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定。方法:以胃泌素合成肽與鑰孔戚血藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物為免疫原,采用雜交瘤技術(shù)建立能穩(wěn)定分泌高親和力抗人胃泌素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,大量制備并經(jīng)鹽析、蛋白G親和層析獲得純化的單克隆抗體,采用SDS-PAGE對(duì)抗體進(jìn)行分子量和純度鑒定,間接ELISA法檢測(cè)效價(jià),雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)鑒定類和亞類,非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定親和力,斑點(diǎn)ELISA和免疫組化鑒定特異性,并且分別采用熒光染色法和MTT比色法,研究其對(duì)胃泌素/胃泌素受體結(jié)合的阻斷作用,以及對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用。在此基礎(chǔ)上,選擇雜交瘤細(xì)胞株E8,用TRIZOL試劑提取總RNA,通過RT-PCR,采用小鼠重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通用引物,擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因。通過重疊延伸PCR將兩個(gè)可變區(qū)基因通過連接肽基因連接起來,構(gòu)建單鏈抗體基因,克隆到pGEM-T載體中,通過酶切、PCR和測(cè)序進(jìn)行鑒定。然后用限制性內(nèi)切酶雙酶切pGEM-gastrin-ScFv質(zhì)粒和pET-28a(+)質(zhì)粒,構(gòu)建pET-gastrin-ScFv重組表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21
【圖文】：

圖1一1McAb制備的技術(shù)路線Figuerl一1PorceduerofrPerParationofmonoclonalantibody.2L2小鼠的免疫和細(xì)胞融合選擇6周齡的BALB/C小鼠，用胃泌素合成膚一KLH偶聯(lián)物作為免疫原，加完全福氏佐劑或不完全福氏佐劑，經(jīng)皮下多點(diǎn)多次免疫小鼠。細(xì)胞融合前3天，，腹腔加強(qiáng)免疫一次。取免疫小鼠脾臟制備脾細(xì)胞懸液，將脾細(xì)胞與SPZ/0骨髓瘤細(xì)胞按10:1比例混合，離心洗滌細(xì)胞2次。末次離心后盡量吸出上清，輕叩管底使細(xì)胞沉淀混勻成糊狀，將離心管置37Co水浴中，緩慢加入lml預(yù)熱的50%PEG4。。。，lmin加完，靜置lmin

0.000.50蛋白濃度(mg/ml)圖1一2蛋白濃度一28。值標(biāo)準(zhǔn)曲線Figurel一2StnadardeuvreofrtherelationshiPbetweenProteineoneentrationandAZoovalue表1一2Tablel一2三株抗人胃泌素McAb腹水鹽析前、后的蛋白濃度TheProteineoneentrationinaseitesofthreestrainsanti一gastrinMeAbbeofreandatferPreeiPitationbymamoniumsulatfe腹水(McAb)鹽析前積(ml)鹽析后鹽析前鹽析后A11252846CZ18203813.610.7ES272959.120.1.3L3蛋白C親和層析純化抗體蛋白G親和層析純化抗體的洗脫峰記錄圖譜見圖1一3。通過間接EusA法，證實(shí)2#洗脫樣品為
【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 方瑾,宋今丹;抗人大腸癌單鏈抗體基因的克隆與表達(dá)[J];癌癥;2002年07期

2 金洪濤,金寧一,王宏偉,江文正,王宏;抗HIV-1gp120單鏈抗體的原核表達(dá)與初步純化[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2002年06期

本文編號(hào)：2697504