【摘要】： 睪丸生殖細(xì)胞的凋亡是一個(gè)由多基因參與的復(fù)雜過(guò)程。目前有關(guān)睪丸生殖細(xì)胞凋亡的研究尚處于起步階段，迄今為止，尚未克隆出特異性的睪丸生殖細(xì)胞凋亡基因。而克隆新的特異性的睪丸凋亡相關(guān)基因是進(jìn)一步了解生殖細(xì)胞凋亡機(jī)制和生物學(xué)過(guò)程的關(guān)鍵所在，對(duì)闡明精子發(fā)生的生理、病理具有重要意義。 在前期的研究工作中，本室姜宏等通過(guò)建立小鼠隱睪模型，運(yùn)用抑制消減雜交法(Suppression subtractive hybridization，SSH)克隆出24個(gè)小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的EST，并在GenBank中登錄。本研究利用巢式PCR技術(shù)和人類基因組草圖搜索法，從上述EST出發(fā)，于2000年6月成功地克隆了人類TSARG2基因及小鼠同源基因SRG2，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究。本研究分為三個(gè)部分，其主要實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：第一章 TSARG2基因的克隆與序列分析 從已獲得的在隱睪和正常睪丸對(duì)照中表達(dá)量有明顯差異的EST片段(BE644542)入手，設(shè)計(jì)了基因特異性引物和載體特異性引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，結(jié)合人類基因組草圖搜索法，從睪丸cDNA文庫(kù)中快速分離出人類睪丸凋亡相關(guān)基因的5′末端而獲得全長(zhǎng)cDNA，GenBank登錄號(hào)為AY040204，同時(shí)應(yīng)用生物信息學(xué)的方法克隆了該基因在小鼠中的同源基因，GenBank登錄號(hào)為AF395083。TSARG2基因的cDNA全長(zhǎng)為1233bp，包含6個(gè)外顯子，基因組跨越115kb，編碼由305個(gè)氨基酸組成的、分子量為34751的蛋白質(zhì)，與已知蛋白質(zhì)無(wú)明顯同源性，其最大可能是一種核蛋白。在該基因-277 到＋163處，有一個(gè)CpG島，其GC含量為61．6％。在CpG島中－191到＋16 處，預(yù)測(cè)出一個(gè) 205 hp的啟動(dòng)子。Northern雜交表明該基因在己檢測(cè)組織 中只在睪丸內(nèi)有高表達(dá)。查詢最新的人類基因組工作草圖，該基因定位在 染色體4q34．134．2。 第二章fSARQ基因功能的初步研究 我們對(duì)已經(jīng)收集的不明原因的特發(fā)性無(wú)精癥和嚴(yán)重少精癥、隱睪癥等 患者及家系共122例進(jìn)行上述基因的突變分祈，未找到該基因的突變。提 示該基因在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用可能主要是通過(guò)表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)而實(shí)現(xiàn)的。 利用PCR方法從人類睪丸CD＊文庫(kù)分離出該基因完整閱讀框CDNA，用 非同位素地高辛標(biāo)記的閱讀框CD帆片段做探針與人類睪丸組織進(jìn)行原位雜 交，觀察刪RQ在生殖腺中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及其可能的功能作用。發(fā)現(xiàn)y艦 在人類翠丸的各級(jí)生精細(xì)胞有較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，均發(fā)現(xiàn)有紫褐色的強(qiáng)雜交信 號(hào)，提示該基因發(fā)揮作用有可能是通過(guò)在精子生成不同階段的差異表達(dá)而 實(shí)現(xiàn)的。 為了進(jìn)一步研究TsRQ基因編碼產(chǎn)物的表達(dá)特征，通過(guò)構(gòu)建增強(qiáng)型綠 色熒光蛋白和 TsRQ基因的真核表達(dá)質(zhì)粒DEGFP個(gè)／TSARQ，脂質(zhì)體介導(dǎo) 轉(zhuǎn)染 COS 7細(xì)胞株，考察 7’sRQ基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn) 7sRQ 融合蛋臼存在于胞核，與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。 將構(gòu)建的 IsRQ原核表達(dá)質(zhì)粒 PGEX－KG／IsRQ不 DGEX－4T－2／ fSARQ， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLZI（DE3），IPTG誘導(dǎo)后特異高效表達(dá)，在DGEX－KG／7AIRQ 和 PGEX－4T－2／7N砒中表達(dá)蛋白分別占菌體總蛋白的 26％和 23％，表達(dá) V 的融合蛋白以包涵體的形式存在。將表達(dá)產(chǎn)物破包涵體后經(jīng)Glutathinone Sepharose 4B柱親和層析分離，SDS－PAGE顯示純化的蛋白質(zhì)為一分子量 60 kD的單一蛋白帶。 我們將 TSARGZ基因與真核表達(dá)載體 pCDNA3＊－）連接后轉(zhuǎn)染人類乳腺 癌MCFJ細(xì)胞，結(jié)果表明該基因能顯著促進(jìn)MCFJ細(xì)胞的生長(zhǎng)。 第三章SRQ基因的分子克隆、序列分析及其在小鼠隱睪中的表達(dá)特征 從已獲得的在隱睪和正常睪丸對(duì)照中表達(dá)量有明顯差異的EST片段 ①E644542）入手，利用網(wǎng)上生物信息學(xué)克隆了該基因全長(zhǎng)，GenBank登錄號(hào) 為AF395083。從小鼠睪丸CDV文庫(kù)中分離出該基因完整閱讀框CDNA，＾；Hu－ 基因的CDNA全長(zhǎng)為1088 hp，包含6個(gè)外顯于，基因組跨越9．4 kb，編 碼由 295個(gè)氨基酸組成、分子量為 33 579、等電點(diǎn)為 9．64的蛋白質(zhì)，與人 類同源基因TNRQ相似性為78訊 而與其他已知蛋白質(zhì)無(wú)明顯同源性。多 組織Northern雜交結(jié)果表明該基因只在睪丸中有高表達(dá)，多組織RT干CR 結(jié)果與多組織Northern雜交結(jié)果一致。分別收集出生前小鼠胚胎與出生后 7大、14天、21大、35天、49大、280天及隱睪14天小鼠宰丸，Northern 雜交結(jié)果表明．－ti＊u－基因在21天小鼠睪丸內(nèi)開(kāi)始表達(dá)，以后表達(dá)水平趨于 穩(wěn)定。同時(shí)將21大、35天、49大、280天小鼠睪丸進(jìn)行組織石蠟切片，結(jié) 果表明小鼠翠丸在第 21天可見(jiàn)精子細(xì)胞，到第 35天，精子生成的最后階 段開(kāi)始發(fā)生，部分牛精小管中可見(jiàn)少量成熟的精于。第49天，小鼠已進(jìn)入 性成熟期，生精小管中可見(jiàn)大量成熟的精子，與第280天小鼠翠丸在形態(tài) 上己無(wú)顯著區(qū)別。上述結(jié)果證明該基因與生精過(guò)程緊密相關(guān)。Sou化e＊雜 VI 交結(jié)果證明在隱睪中無(wú)．－nvs基因的丟失或重排，但其CPG島有甲基化現(xiàn)象。 應(yīng)用新型的分子信標(biāo)檢測(cè)該基因在不同時(shí)期隱睪中的mRNA表
【圖文】：

圖3一16.SRGZ基因在小鼠10種組織中RT一PCR分析因在小鼠10種組織中RT.pCR分析;l，翠丸;2，心臟;3，骨骼肌;4，肝臟;5，肺，卵巢;(B)RT.PCR擴(kuò)增G3pDH作為RNA模板質(zhì)量對(duì)照Fig3·16.RT·PCRana】ysisofSRGZin10kindsoftissuesofmouseanalysisofSRGZinvarioustissuesofmouse;l，testis:2，heart:3，skeletaln:7，ePididy而s:8，sPleen:9，kidney:10，ovary:(B)AmPlifieationofG3RNAquality.雜交結(jié)果GZ基因探針制備物mousellmouseZ以pUCm-TISRGZ質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PcR烯酞胺凝膠電泳檢驗(yàn)，在883bp和1116bP間有特異性條帶，小預(yù)計(jì)為92lbP，完全符合。標(biāo)記后的探針經(jīng)2%的瓊脂糖電

2.3Northern雜交用Q一犯P一dCTP標(biāo)記丑沮尺GZ基因片段與多種人類常見(jiàn)組織MTN膜進(jìn)行Northem雜交，以檢測(cè)2萬(wàn)減RGZ基因在多種正常組織的表達(dá)。結(jié)果(圖1一4)表明該基因只在辜丸中有高表達(dá)，轉(zhuǎn)錄本大小為1.7kb，而在脾、胸腺、前列腺、卵巢、小腸、大腸(無(wú)粘膜)和外周血白細(xì)胞中未檢測(cè)到表達(dá)。2345678徽一萬(wàn)5浦刀f扮圖1·4.雙沉RGZ基因在人類8種組織中Northern雜交分析1，脾;么胸腺;3，，前列腺;4，皋丸;5，卵巢;6，小腸;7
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2697204