【摘要】：研究表明，人體內(nèi)存在的天然抗角蛋白自身抗體(anti-keratin auto antibody，AK auto Abs)存在于人和多種動物體內(nèi)，構(gòu)成了免疫系統(tǒng)的基本組成部分，參與免疫自穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。在一些病理情況下(如銀屑病、接觸性皮炎等)，AK auto Abs的存在有利于限制病情進(jìn)展，促進(jìn)損傷修復(fù)，對機(jī)體具有保護(hù)作用。本室發(fā)現(xiàn)AK auto Abs主動介入某些皮膚病的病理生理過程，無論是來自皮損或者正常人血清的AK auto Abs都以劑量依賴的方式抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化；輸注含高滴度AK auto Abs的人血丙種球蛋白，在部分銀屑病患者收到了較好的效果，從血清中提取的AK auto Abs在動物實(shí)驗(yàn)中也初步顯示了有希望的治療應(yīng)用前景，但由于血液制品的來源和安全性問題而限制了AK auto Abs的臨床應(yīng)用。 噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)為不經(jīng)免疫制備人源性抗角蛋白抗體提供了可能。國內(nèi)外已經(jīng)從噬菌體抗體庫中成功地制備了多種單克隆抗體，本實(shí)驗(yàn)室從半合成的噬菌體抗體庫中成功地篩選到抗角蛋白的噬菌體抗體Fab和ScFv，并初步得到可溶性表達(dá)的抗角蛋白單克隆抗體Fab，其具有較高的特異性和親和力，為抗角蛋白NAA的應(yīng)用及進(jìn)一步研究提供了良好的手段。研 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 究發(fā)現(xiàn)，這些抗體片段具有抑制培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的作用，從噬菌體 抗體庫中篩選出來的抗體分子在很多情況下可滿足應(yīng)用的需要，但由于沒有 Fc段而不具備抗體的某些生物學(xué)功能，如激活補(bǔ)體、ADCC(抗體依賴性細(xì) 胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用)以及免疫調(diào)節(jié)等。在某些情況下，尤其用于體內(nèi)治療 時，需要使用完整的抗體分子。親和力是抗體的重要參數(shù)，在體內(nèi)只有親和 力高的抗體才能發(fā)揮有效的生物學(xué)作用。在生物技術(shù)領(lǐng)域，親和力高的抗體 有著明顯較高的使用價值，因此，對于從噬菌體抗體庫篩選出的抗體，只有 及時評價抗體的親和力，才能選擇出性能優(yōu)良的抗體。為此我們選擇親和力 最高的Fab或scFv克隆，克隆抗體的可變區(qū)基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體，脂 質(zhì)體Lipofeetamine2000轉(zhuǎn)染二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷的CHO細(xì)胞， 在MTx加壓條件下，表達(dá)抗人角蛋白全長IgG抗體，并檢測抗體的生物學(xué) 活性。 本室己經(jīng)從半合成噬菌體抗體庫篩選出7株抗角蛋白ScFv和4株抗角 蛋白Fab。通過ELISA檢測抗體活性及特異性，并進(jìn)行了研慫stem blot分析。 篩選親和力最高的抗體克隆尤其重要，而目前通常采用硫氰酸胺法或生物傳 感器來測定抗體的相對親和力，一由于噬菌體ScFv切除基因m后不能自連， 因此不能表達(dá)出抗體片段，也無法預(yù)知抗體的活性，不能應(yīng)用生物傳感器測 定抗體的親和力。因此我們利用曾經(jīng)篩選到的4株抗角蛋白噬菌體Fab抗體 片段，通過內(nèi)切酶NFhel切除載體上的基因111，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性抗體 Fab片段，應(yīng)用鎳親和層析柱純化抗體，生物傳感器測定抗體親和力，選擇 親和力最高的克隆。親和力最高的克隆質(zhì)粒送上海生物工程公司測序，根據(jù) 測序結(jié)果和前導(dǎo)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)(VK和VH)基因以及連 接前導(dǎo)序列的引物。經(jīng)過PCR擴(kuò)增帶有前導(dǎo)序列的輕、重鏈可變區(qū)基因(LK 和LH)。經(jīng)Xbal和BamHI酶切LK，分別插入同樣酶切的載體pWD和pWSD3， 構(gòu)建帶有LK的載體pWD、和pWSD3K;經(jīng)Xhol和Hind 111酶切LH，分別插 入同樣酶切的載體pWDK和pWSD3K，構(gòu)建帶有目的基因輕、重鏈抗體可變區(qū) 基因的真核表達(dá)載體pWD出和pwSD3妞。分別進(jìn)行酶切、PcR和測序鑒定 正確:經(jīng)LipofectamineZo00轉(zhuǎn)染CHo(dhfr一)細(xì)胞，72小時后檢測抗體的瞬 時表達(dá);在氨甲喋吟伽TX)加壓篩選條件下，亞克隆化篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 系，Rl’- pCR檢測抗體在mRNA水平的表達(dá)，ELISA檢測抗人角蛋白全長IgG 抗體的表達(dá)，，W七stem blot分析抗體識別角蛋白的相對分子質(zhì)量;收集表達(dá)的 上清液，作用于培養(yǎng)的鱗癌細(xì)胞，MTT檢測表達(dá)的全長IgG抗體對細(xì)胞增 殖的影響。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，7株人抗角蛋白噬菌體SeFVHAKSS、HAKS 19、HAKS 21、 HAKS 24、HAKS 28、HAKS 31和HAKS 41能特異性識別人角蛋白，而與 轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰蛋白酶、人工gG、TRP一1等抗原無交叉結(jié)合反應(yīng)，其識別角蛋 白的相對分子質(zhì)量約在56 000一57 000之間，包括角蛋白K5和K6;DNA測 序表明HAKSS、19和21的VL屬人19入鏈第二亞群，HAKS 24和28的VL 屬人Ig入鏈第一亞群，HAKS31和41的vL屬人IgK鏈第三亞群;HAKSS 的重鏈可變區(qū)基因(vH)屬人IgG第一亞群，噬菌體HAKS 19、21、24、 24、31和41的VH屬第三亞群。其中HAKS 31和41的輕重鏈完全一樣， 是同一個克隆;經(jīng)過硫氰酸胺檢測，HAKss和HAKS19的相對親和力最小， 較接近;HAKS28、31和HAKS41的相對親和力最大，比較一致;HAKS 21 和HAK24的相對親和力較接近;7株角蛋白噬菌體scFv的相對親和力由大 到小為:HAKS 31二HAKS 41二HAKS 28HAKS藝1、HAKS 24)HAKSS、HAKS 19; 由于噬菌體ScFv不能表達(dá)出可溶性抗體片段，無法應(yīng)用生物傳感器較精確 地測定抗體的親和力。因此我們利用曾經(jīng)篩選到的4株抗角蛋白噬菌體Fab 抗體，通過表達(dá)和純化可溶性抗體Fab片段，應(yīng)用生物傳感器測定抗體的相 對親和力，在4株抗角蛋白噬菌體Fab片段中來選擇親和力最高的抗體，結(jié)
【圖文】：

1.1抗角蛋白噬菌體scFv的特異性鑒定:經(jīng)ELISA檢測有7株ScFv與角蛋白均有良好的結(jié)合活性，與轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰蛋白酶、GST和TRPI等無關(guān)抗原不結(jié)合或反應(yīng)很弱，具備特異性(見圖2)。這7株抗體分別稱為HAKSS、HAKS19、HAKSZI、HAKS24、HAKS28、HAKS31和HAKS41。圖2抗角蛋白噬菌體ScFv的特異性檢測Fig2ELISAresultsofanti一keratinPhageScFvagainstdifferentantigens1.27株抗角蛋白噬菌體scFv的相對親和力經(jīng)過硫氰酸胺檢測，HAKSS和HAKS19的相對親和力最小，較接近;HAKS28、31和HAKS41的相對親和力最大，比較一致;HAKSZI和HAKS24的相對親和力較接近;7株角蛋白噬菌體ScFv的相對親和力由大到小為:HAKS31二HAKS41詡AKS28>HAKSZI“HAKS24>HAKSS“HAKS19(見圖3)。

HAKS21、HAKS24、HAKS28、HAKS31和HAKS41進(jìn)行染色，均在相對分子質(zhì)量為56000一57000處出現(xiàn)單一著色條帶，說明各抗體均特異性識別同一角蛋白組分(見圖4)。圖4抗角蛋白SeFv的W七sternblotFig4W七stemblotresultsofanti一keratinScFv
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2697167