【摘要】：血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅僅是血液和組織間的一道機(jī)械屏障，而且是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、異質(zhì)的、播散分布的器官，具有重要的分泌、合成、代謝和免疫功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞是創(chuàng)傷、感染、休克、心血管疾病、腫瘤等多種疾病中極易受損的細(xì)胞，同時(shí)也是參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)、創(chuàng)傷組織修復(fù)的重要成員，其增殖和分化的相互協(xié)調(diào)是燒傷、創(chuàng)傷后創(chuàng)面愈合和修復(fù)關(guān)鍵因素之一。 本室前期研究發(fā)現(xiàn)：人鈣／鈣調(diào)蛋白依賴的絲氨酸蛋白激酶(CASK)可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304細(xì)胞的增殖，而其調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用機(jī)制尚不清楚，對此深入探討將有助于我們對創(chuàng)傷修復(fù)等涉及血管發(fā)生、重建的病理生理現(xiàn)象的理解。 CASK的主要功能是作為一個(gè)支架蛋白質(zhì)參與細(xì)胞膜蛋白骨架的構(gòu)建，細(xì)胞連接的形成，以及調(diào)節(jié)功能蛋白質(zhì)的分布，參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和基因調(diào)控等。我們發(fā)現(xiàn)，人血管內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304中CASK能夠與分化抑制因子1(Id1)相互作用。Id家族屬于HLH蛋白，其結(jié)構(gòu)中不含有與DNA特異性結(jié)合的堿性區(qū)，與很多bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成無功能活性的異二聚體，是bHLH家族的負(fù)調(diào)控因子，在細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)中具有重要作用。CASK與Id1在物理結(jié)構(gòu)上存在相互作用提示兩者可能在生物學(xué)功能上有所關(guān)聯(lián)。本室對此做了一些探索性工作，我們發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CASK的ECV304細(xì)胞的生長率顯著降低，細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子p16、p21表達(dá)上調(diào)，我們推測CASK過表達(dá)后所觀察到的細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象可能與Id1有關(guān)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上推測和深入了解CASK抑制細(xì)胞增殖的信號(hào)機(jī)制，我們從幾個(gè)方面進(jìn)行了初步探索。 本室前期的研究已經(jīng)成功構(gòu)建了CASK過表達(dá)的ECV304細(xì)胞，本課題主要承擔(dān)CASK缺陷表達(dá)ECV304細(xì)胞模型的建立以及CASK影響細(xì)胞增殖的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制研究。采用近年發(fā)展起來的RNA干擾技術(shù)(RNAi)，應(yīng)用質(zhì)粒載體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)小干擾RNA(siRNA)表達(dá)策略，共設(shè)計(jì)和成功構(gòu)建7個(gè)siRNA表達(dá)質(zhì)粒，分別對應(yīng)于靶基因CASK、Id1，報(bào)告基因螢火蟲熒光素酶、EGFP和GFP，全部經(jīng)測序驗(yàn)證。 首先通過重組siRNA表達(dá)質(zhì)粒對外源報(bào)告基因EGFP和螢火蟲熒光素酶的抑制效果，確認(rèn)了載體介導(dǎo)的RNAi策略在ECV304細(xì)胞中應(yīng)用的可行性。根據(jù)蛋白和mRNA 第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 水平的阻斷效率，篩選出對內(nèi)源性靶基因CASK和Idl抑制效率較高的重組質(zhì)粒。應(yīng)用 RNAi方法抑制CASK表達(dá)，ECV3O4細(xì)胞生長加快，而CASK過表達(dá)，ECV304細(xì)胞生 長受到一定的抑制，實(shí)驗(yàn)從正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)兩個(gè)方向證明，CASK能夠參與ECv304細(xì) 胞增殖的抑制信號(hào)。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，應(yīng)用RNAi方法抑制CASK表達(dá)，ECV304 細(xì)胞的增殖指數(shù)(PI)明顯高于對照組，細(xì)胞較多地進(jìn)入有絲分裂期和DNA合成期，這 從另一個(gè)側(cè)面說明，CASK是ECV3O4增殖的負(fù)調(diào)控分子。 本研究結(jié)果顯示，CASK過表達(dá)時(shí)，Idl與其拼接型Idl’的mRNA組成比例發(fā)生 顯著的改變，Idl逐漸減少，而Idl’逐漸增高。我們推測CASK調(diào)節(jié)Idl和Idl’的組 成比例可能是CASK抑制細(xì)胞增殖的原因之一。同時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制 Idl表達(dá)削弱了CASK對細(xì)胞增殖的影響，提示Idl參與了CASK抑制細(xì)胞增殖的信號(hào)。 Idl分子通過與bHLH類轉(zhuǎn)錄因子形成無功能活性的異二聚體而抑制bHLH家族 轉(zhuǎn)錄因子的活性，有研究證實(shí)，周期素依賴的蛋白激酶抑制因子pl6和pZI在哺乳動(dòng) 物細(xì)胞中受bHLH轉(zhuǎn)錄因子和Idl分子的共同調(diào)節(jié)，因此我們觀察了CASK下調(diào)表達(dá) 情況下P16和/或pZI的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以RNAi方法抑制cAsK的表達(dá)，P16 和P21的表達(dá)也受到了明顯的抑制，這提示cAsK抑制細(xì)胞增殖的生物學(xué)效應(yīng)可能是 通過pl6和/或pZI影響細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)的。 為深入探討CAsK影響pl6和pZI表達(dá)的機(jī)制，我們研究了cAsK表達(dá)抑制或者 增強(qiáng)的情況下，ldl與bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員EZA形成二聚化的定量改變，結(jié)果表明， 當(dāng)CASK表達(dá)增加時(shí)，與EZA分子免疫共沉淀的Idl減少，相反當(dāng)CASK表達(dá)抑制時(shí)， 與EZA分子免疫共沉淀的Idl明顯增多。提示同樣作為Idl分子的結(jié)合伙伴，CASK與 EZA分子可能存在類似競爭的關(guān)系。 通過上述研究，我們提出一個(gè)尚未見報(bào)道的哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖抑制信號(hào):細(xì)胞外(細(xì) 胞間質(zhì))信號(hào)傳遞到支架蛋白CASK，CASK與細(xì)胞內(nèi)分子Idl結(jié)合，減少了Idl與bHLH 類轉(zhuǎn)錄因子EZA的結(jié)合，由于Idl是EZA負(fù)調(diào)控因子，，EZA轉(zhuǎn)錄因子與Idl結(jié)合減 少，相應(yīng)地對某些下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，通過結(jié)合p21/P16基因調(diào)控序列的 E一box(CANNTG)區(qū)，促進(jìn)pl6、pZI表達(dá)增加，抑制細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，抑制細(xì)胞增殖。
【圖文】：

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文個(gè)大的轉(zhuǎn)錄因子家族bHLH家族成員的負(fù)向調(diào)控因子，bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控p16、pZI的表達(dá)業(yè)已在某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到證實(shí)，而Idl通過負(fù)調(diào)節(jié)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，抑制p21、pl6基因的表達(dá)[20，2l，22]、促進(jìn)細(xì)胞增殖。我們推斷可能存在一條尚未被證實(shí)的調(diào)節(jié)ECV304細(xì)胞增殖的信號(hào)通路(見圖l):CASK通過與Idl的結(jié)合，間接影響了某種(些)bHLH類轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而影響了參與細(xì)胞增殖或細(xì)胞周期調(diào)控的效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，最終抑制細(xì)胞的增殖。

APal和EcoRI酶切線性化過程中，切除的多克隆位點(diǎn)片斷中含有Hindlll單酶切位點(diǎn)，而重組陽性質(zhì)粒失去了Hindnl酶切位點(diǎn)，不能被孤ndm酶切。利用這個(gè)特點(diǎn)，可以對陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行初步鑒定，圖1為兩個(gè)陽性重組質(zhì)粒siCASK一1和siCASK一2的Hindm酶切電泳結(jié)果，可見pBS用6空載體可以被Hindm酶切成線性，電泳呈現(xiàn)單一帶型(線性化質(zhì)粒)，而陽性重組質(zhì)粒未被線性化。圖1、重組siRNA表達(dá)質(zhì)粒的Hindlll酶切鑒定Figure1IdentifieationofreeonstrUetedsiRNAPlaslnidsbyHindflldigestionM:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);l、PBS/U6;2、siCASK一l;3、siCASK一2.2、psileneer3.IHI一Hygro為載體的siRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建psilencer3.IHI一Hygro為Ambinn公司的一種以siRNA表達(dá)載體，它主要的特點(diǎn)是含有人HlRNA聚合酶m啟動(dòng)子，并且加入了真核細(xì)胞的篩選標(biāo)記潮霉素抗性基因。^mbion公司提供少量線性化(經(jīng)BamHI和Hind111雙酶切)的psileneer3.IHI一Hy盯。載體無法進(jìn)行擴(kuò)增，本研究首先以線性化載體構(gòu)建了siGFP重組質(zhì)粒，經(jīng)過序列比對，該重組質(zhì)粒仍然含有BamHI和Hindm雙酶切位點(diǎn)
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉煜,趙曉航,吳e

本文編號(hào)：2695682