【摘要】：血管內(nèi)皮細胞不僅僅是血液和組織間的一道機械屏障，而且是一個動態(tài)的、異質(zhì)的、播散分布的器官，具有重要的分泌、合成、代謝和免疫功能。血管內(nèi)皮細胞是創(chuàng)傷、感染、休克、心血管疾病、腫瘤等多種疾病中極易受損的細胞，同時也是參與機體應激反應、創(chuàng)傷組織修復的重要成員，其增殖和分化的相互協(xié)調(diào)是燒傷、創(chuàng)傷后創(chuàng)面愈合和修復關鍵因素之一。 本室前期研究發(fā)現(xiàn)：人鈣／鈣調(diào)蛋白依賴的絲氨酸蛋白激酶(CASK)可以抑制血管內(nèi)皮細胞株ECV304細胞的增殖，而其調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞增殖的作用機制尚不清楚，對此深入探討將有助于我們對創(chuàng)傷修復等涉及血管發(fā)生、重建的病理生理現(xiàn)象的理解。 CASK的主要功能是作為一個支架蛋白質(zhì)參與細胞膜蛋白骨架的構(gòu)建，細胞連接的形成，以及調(diào)節(jié)功能蛋白質(zhì)的分布，參與細胞的信號傳導和基因調(diào)控等。我們發(fā)現(xiàn)，人血管內(nèi)皮細胞株ECV304中CASK能夠與分化抑制因子1(Id1)相互作用。Id家族屬于HLH蛋白，其結(jié)構(gòu)中不含有與DNA特異性結(jié)合的堿性區(qū)，與很多bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成無功能活性的異二聚體，是bHLH家族的負調(diào)控因子，在細胞增殖和分化的調(diào)節(jié)中具有重要作用。CASK與Id1在物理結(jié)構(gòu)上存在相互作用提示兩者可能在生物學功能上有所關聯(lián)。本室對此做了一些探索性工作，我們發(fā)現(xiàn)，過表達CASK的ECV304細胞的生長率顯著降低，細胞周期依賴性激酶抑制因子p16、p21表達上調(diào)，我們推測CASK過表達后所觀察到的細胞增殖抑制現(xiàn)象可能與Id1有關，為了進一步驗證以上推測和深入了解CASK抑制細胞增殖的信號機制，我們從幾個方面進行了初步探索。 本室前期的研究已經(jīng)成功構(gòu)建了CASK過表達的ECV304細胞，本課題主要承擔CASK缺陷表達ECV304細胞模型的建立以及CASK影響細胞增殖的細胞內(nèi)信號機制研究。采用近年發(fā)展起來的RNA干擾技術(shù)(RNAi)，應用質(zhì)粒載體介導的細胞內(nèi)小干擾RNA(siRNA)表達策略，共設計和成功構(gòu)建7個siRNA表達質(zhì)粒，分別對應于靶基因CASK、Id1，報告基因螢火蟲熒光素酶、EGFP和GFP，全部經(jīng)測序驗證。 首先通過重組siRNA表達質(zhì)粒對外源報告基因EGFP和螢火蟲熒光素酶的抑制效果，確認了載體介導的RNAi策略在ECV304細胞中應用的可行性。根據(jù)蛋白和mRNA 第三軍醫(yī)大學博士學位論文 水平的阻斷效率，篩選出對內(nèi)源性靶基因CASK和Idl抑制效率較高的重組質(zhì)粒。應用 RNAi方法抑制CASK表達，ECV3O4細胞生長加快，而CASK過表達，ECV304細胞生 長受到一定的抑制，實驗從正調(diào)節(jié)和負調(diào)節(jié)兩個方向證明，CASK能夠參與ECv304細 胞增殖的抑制信號。流式細胞術(shù)分析表明，應用RNAi方法抑制CASK表達，ECV304 細胞的增殖指數(shù)(PI)明顯高于對照組，細胞較多地進入有絲分裂期和DNA合成期，這 從另一個側(cè)面說明，CASK是ECV3O4增殖的負調(diào)控分子。 本研究結(jié)果顯示，CASK過表達時，Idl與其拼接型Idl’的mRNA組成比例發(fā)生 顯著的改變，Idl逐漸減少，而Idl’逐漸增高。我們推測CASK調(diào)節(jié)Idl和Idl’的組 成比例可能是CASK抑制細胞增殖的原因之一。同時，細胞計數(shù)實驗結(jié)果表明，抑制 Idl表達削弱了CASK對細胞增殖的影響，提示Idl參與了CASK抑制細胞增殖的信號。 Idl分子通過與bHLH類轉(zhuǎn)錄因子形成無功能活性的異二聚體而抑制bHLH家族 轉(zhuǎn)錄因子的活性，有研究證實，周期素依賴的蛋白激酶抑制因子pl6和pZI在哺乳動 物細胞中受bHLH轉(zhuǎn)錄因子和Idl分子的共同調(diào)節(jié)，因此我們觀察了CASK下調(diào)表達 情況下P16和/或pZI的表達。實驗結(jié)果表明，以RNAi方法抑制cAsK的表達，P16 和P21的表達也受到了明顯的抑制，這提示cAsK抑制細胞增殖的生物學效應可能是 通過pl6和/或pZI影響細胞周期轉(zhuǎn)換而實現(xiàn)的。 為深入探討CAsK影響pl6和pZI表達的機制，我們研究了cAsK表達抑制或者 增強的情況下，ldl與bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員EZA形成二聚化的定量改變，結(jié)果表明， 當CASK表達增加時，與EZA分子免疫共沉淀的Idl減少，相反當CASK表達抑制時， 與EZA分子免疫共沉淀的Idl明顯增多。提示同樣作為Idl分子的結(jié)合伙伴，CASK與 EZA分子可能存在類似競爭的關系。 通過上述研究，我們提出一個尚未見報道的哺乳動物細胞增殖抑制信號:細胞外(細 胞間質(zhì))信號傳遞到支架蛋白CASK，CASK與細胞內(nèi)分子Idl結(jié)合，減少了Idl與bHLH 類轉(zhuǎn)錄因子EZA的結(jié)合，由于Idl是EZA負調(diào)控因子，，EZA轉(zhuǎn)錄因子與Idl結(jié)合減 少，相應地對某些下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性增強，通過結(jié)合p21/P16基因調(diào)控序列的 E一box(CANNTG)區(qū)，促進pl6、pZI表達增加，抑制細胞周期轉(zhuǎn)換，抑制細胞增殖。
【圖文】：

第三軍醫(yī)大學博士學位論文個大的轉(zhuǎn)錄因子家族bHLH家族成員的負向調(diào)控因子，bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控p16、pZI的表達業(yè)已在某些哺乳動物細胞中得到證實，而Idl通過負調(diào)節(jié)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，抑制p21、pl6基因的表達[20，2l，22]、促進細胞增殖。我們推斷可能存在一條尚未被證實的調(diào)節(jié)ECV304細胞增殖的信號通路(見圖l):CASK通過與Idl的結(jié)合，間接影響了某種(些)bHLH類轉(zhuǎn)錄因子的活性，進而影響了參與細胞增殖或細胞周期調(diào)控的效應分子的轉(zhuǎn)錄、表達，最終抑制細胞的增殖。

APal和EcoRI酶切線性化過程中，切除的多克隆位點片斷中含有Hindlll單酶切位點，而重組陽性質(zhì)粒失去了Hindnl酶切位點，不能被孤ndm酶切。利用這個特點，可以對陽性重組質(zhì)粒進行初步鑒定，圖1為兩個陽性重組質(zhì)粒siCASK一1和siCASK一2的Hindm酶切電泳結(jié)果，可見pBS用6空載體可以被Hindm酶切成線性，電泳呈現(xiàn)單一帶型(線性化質(zhì)粒)，而陽性重組質(zhì)粒未被線性化。圖1、重組siRNA表達質(zhì)粒的Hindlll酶切鑒定Figure1IdentifieationofreeonstrUetedsiRNAPlaslnidsbyHindflldigestionM:DNA分子量標準;l、PBS/U6;2、siCASK一l;3、siCASK一2.2、psileneer3.IHI一Hygro為載體的siRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建psilencer3.IHI一Hygro為Ambinn公司的一種以siRNA表達載體，它主要的特點是含有人HlRNA聚合酶m啟動子，并且加入了真核細胞的篩選標記潮霉素抗性基因。^mbion公司提供少量線性化(經(jīng)BamHI和Hind111雙酶切)的psileneer3.IHI一Hy盯。載體無法進行擴增，本研究首先以線性化載體構(gòu)建了siGFP重組質(zhì)粒，經(jīng)過序列比對，該重組質(zhì)粒仍然含有BamHI和Hindm雙酶切位點
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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1 劉煜,趙曉航,吳e

本文編號：2695682