【摘要】：哺乳動物Toll like receptors(TLRs)是果蠅Toll的同系物，它們構(gòu)成一個新的蛋白家族，參與天然免疫的介導和獲得性免疫的激活。自1997年發(fā)現(xiàn)第一個哺乳動物TLRs以來，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了小鼠的TLRs有9個(即mTLR1-9)；人的TLRs有10個(即TLR1-10)中。研究表明，TLRs家族的作用并不僅限于抗感染免疫，還可參與抗原遞呈、誘導免疫耐受、細胞凋亡，并以此在自身免疫病、超敏反應、移植排斥及腫瘤免疫中發(fā)揮作用。在過去幾年中，TLR-2作為脊椎動物蛋白TLR家族的一員，得到廣泛的研究。TLR-2可介導多種不同的病原微生物(尤其是革蘭氏陽性菌、分枝桿菌及螺旋體等)及其產(chǎn)物引起的、性質(zhì)相似的細胞信號轉(zhuǎn)導活動及細胞因子產(chǎn)生。因此,TLR-2被認為是具中心作用的或中樞型識別(central pattern recognition)受體。盡管有許多體外實驗證實了TLR-2參與免疫相關(guān)事件，但是來自體內(nèi)實驗關(guān)于TLR-2功能的數(shù)據(jù)很少。 小鼠和人的TLR-2都是果蠅TLR-2的同源蛋白，兩者在氨基酸水平上有83％的同源性�；趍TLR-2與hTLR-2結(jié)構(gòu)的高度同源性，及在分布、生物學活性方面的諸多相似，小鼠無疑是研究TLR-2結(jié)構(gòu)、功能及其結(jié)合肽特性的良好模型。本研究擬對小鼠TLR-2進行克隆、表達及其抗體的生物活性研究。首先對小鼠TLR-2的全基因及部分基因進行克隆、表達；制備抗mTLR-2胞外段B細胞識別表位抗體；在獲得了抗mTLR-2抗體的基礎(chǔ)上，進行抗mTLR-2抗體抗過敏和腫瘤抑制實驗，從整體水平上來研究TLR-2的生物學功能。 第一部分 mTLR-2基因的克隆及在不同體系中的表達 根據(jù)已發(fā)表的mTLR-2的全基因序列，采用Primer premier 5.0軟件，設(shè)計并合成以下兩對引物。以P2,P4為引物，以Balb／c小鼠肝臟eDNA為模板的PCR反應，擴增出約1500bp特異性擴增帶，而以P1,P3為引物的PCR反應，擴增出約1400bp特異性擴增帶通過藍白斑篩選挑選，并經(jīng)PCR和測序鑒定，分別獲得上游陽性克隆U3和下游陽性克隆D4。以 u3、04為模板，以PZ，P4為引物的pCR反應，擴增出約2 soobp特異性 擴增帶，將其克隆至puCm一T載體中，經(jīng)PcR和測序鑒定，獲得 puc一mTLR一2重組質(zhì)粒。經(jīng)測序鑒定，表明獲得mTLR一2基因，該序列 已被GenBank收錄(AY179346)，與已發(fā)表的mTLR一2的同源性為99.84%。 在線運行BLASTZ，AY179346與標準mTLR一2 eDNA序列AF124741之 間有4個堿基的差別。分別是515位由t變?yōu)閏，963位由t變?yōu)閏位， 2476位由a變?yōu)間，2500位由t變?yōu)�。由AY179346推導而來的氨基酸 與AF 124741所編碼的氨基酸序列比較，有3個氨基酸的差異，分別是 F266L，Q770R，L778P。 從體外獲取mTLR一2蛋白，對于從細胞模型及動物模型進行TLR一2 的研究具有重要意義。選用哺乳動物CHO細胞表達系統(tǒng)、畢赤酵母表達 系統(tǒng)及大腸桿菌原核表達系統(tǒng)對全長及部分mTLR一2基因進行表達研 究。(l)將目的基因克隆到真核表達載體peDNA3 .1中，成功構(gòu)建了 PcDNA一mTLR一2重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到CHo細胞，用G418篩選陽性 克隆。PCR檢測表明外源基因得到穩(wěn)定整合，Westem blot分析顯示在 分子量約95 000處可見清晰的陽性反應條帶。免疫組織化學和流式細胞 術(shù)檢測顯示轉(zhuǎn)染細胞表達mTLR一2。(2)將目的基因編碼序列插入畢赤酵 母表達載體pPICZac中，獲得重組質(zhì)粒pPIcz一mTLR一2，采用電穿孔法 轉(zhuǎn)化畢赤酵母。重組酵母以PeR、RT一PCR驗證，sDs一AGE和Westem blot 分析顯示，在相對分子量為約97 000處有1特異蛋白帶，且能與抗 mTLR一2多抗發(fā)生反應。(3)采用PcR技術(shù)，擴增編碼mTLR一ZN端153 氨基酸的基因，并將其克隆到pET32a載體中，成功構(gòu)建了融合表達載體 pET一，融合蛋白在大腸桿菌中高效表達，采用Probond樹脂柱純化融合 蛋白。 第二部分抗mTLR一2胞外段抗體的制備與鑒定 制備兩種抗mTLR一2胞外段抗體。(1)在對小鼠Toll樣受體 2(mTLR一2)B細胞優(yōu)勢表位預測的基礎(chǔ)上，合成B細胞識別表位20mer短 膚，將其與載體蛋白偶聯(lián)，制備免疫原。經(jīng)ELISA方法檢測抗體滴度為 1:25 600，采用spG柱純化法獲得兔抗mTLR一2胞外段B細胞識別表位 多克隆抗體TSP一1;采用抗原膚親和層析純化法獲得兔抗mTLR一2胞外 段B細胞識別表位抗體TSP一2。Westem blot分析顯示在相對分子量約 95 000處可見清晰的反應條帶;免疫組織化學和流式細胞術(shù)檢測顯示抗 體可與表達天然mTLR一2的J774A.1細胞反應。(2)將已獲得的N端融合 蛋白免疫動物，獲取抗mTLR一2多表位抗體。經(jīng)ELISA方法檢測抗體滴 度為1:16 000，采用spG柱純化法獲得兔抗mTLR一2胞外段B細胞識別 表位多克隆抗體TsP一3。流式細胞術(shù)檢測顯示TsP一3可與25.5%的 CHO一mTLR一2細胞反應。 第三部分抗mTLR一2胞外段B細胞識別表位抗體抑制肉瘤生長的研究 以小鼠肉瘤株5180細胞注射小鼠左后肢，其中TSP一l組混合有100 雌純化抗體TSP一1，RlgG組混合有100雌正常兔lgG，Sahne組僅接種 5180。小鼠經(jīng)麻醉分別于10d、14d、18d處死，TSP一l組瘤重在10d、14d、 18d與Saline組相比差異顯著(p0.02、p0.05、P0.05);抑瘤率分別 為77%、51%和53%。局部應用抗mTLR一2胞外段B細胞識別表位抗 體可抑制小鼠肉瘤5180生長，且主要表現(xiàn)在腫瘤生長的早期。
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26901882圖1一6pcDNA一InTLR一2的瓊脂糖凝膠電泳鑒定Fig.1一IdentineationofPeDNA一mTLR-2byagarosegeleleetroPhoresisM:入尸EeoT141Markerl:PeDNA一mTLR一2/Notl+Xbal2:PCRProductofPeDNA一mTLR-2二、G418篩選細胞經(jīng)G418持續(xù)篩選，未轉(zhuǎn)染細胞一周內(nèi)全部死亡，兩周時轉(zhuǎn)染細胞大部分死亡，持續(xù)加壓三周可見散在的G418抗性細胞克隆(圖1一7)。圖1一7G418篩選單克隆細胞Fig.l一7SereeningofmonoclonaleellbyG418A:nonnalCHOeellB:monoelonaleellseleetedbyG418一23-

三、PCR檢測外源基因的整合PCR擴出2350bp左右的目的帶，表明外源基因得到穩(wěn)定整合(圖1一8)。麟，圖1一8外源基因整合的PCR鑒定Fig.l一8PCRanalysisofexogenousgeneM:DL15000Markerl:CHOeell�！痑nsfectedwithpeDNA一TLR-2四、轉(zhuǎn)染細胞表達鑒定在以抗mTLR-2多克隆抗體TSP一1為一抗的mTLR-2表達檢測中，轉(zhuǎn)染細胞裂解液的Westemblot檢測發(fā)現(xiàn)，在分子量約95000處可見清晰的陽性反應條帶，表明轉(zhuǎn)染細胞中有mTLR-2的表達(圖1一9)。免疫組織化學檢測顯示，轉(zhuǎn)染細胞出現(xiàn)較強的棕黃色著色，未轉(zhuǎn)染細胞無棕黃色著色(圖1一10)。FCM檢測顯示，41.9%以上轉(zhuǎn)染細胞，對照細胞僅有5%有熒光反應(圖1一11)。以上結(jié)果充分表明轉(zhuǎn)染細胞表面存在mTLR一2。卜班令
【學位授予單位】：第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392

【參考文獻】

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2 徐培君,孫書方,顧冠彬,萬海燕;鏈球菌制劑SM對S180荷肉瘤小鼠的抑瘤作用[J];蘇州大學學報(醫(yī)學版);2002年03期

3 楊U，

本文編號：2695466