【摘要】：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是通過向分化的體細(xì)胞轉(zhuǎn)入特定的外源轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行重編程,從而獲得具有自我更新能力和多能性的細(xì)胞。iPSCs具有形成體內(nèi)所有細(xì)胞類型的潛能,尤其是能以患者自身體細(xì)胞制備iPSCs可用于特定疾病的治療,不但能解決干細(xì)胞臨床應(yīng)用所遇到的免疫排斥問題和倫理醫(yī)學(xué)等難題,而且在基礎(chǔ)研究、再生醫(yī)學(xué)以及藥理科學(xué)中也有著廣闊的發(fā)展前景和重要的意義。 目前,iPSCs的來源主要是將細(xì)胞導(dǎo)入外源基因進(jìn)行重編程而獲得。但是根據(jù)細(xì)胞種類的不同,所采用的具體基因組合和轉(zhuǎn)基因方式各不相同,獲得的iPSCs的質(zhì)量也不盡相同,存在著安全性等方面的隱患。為提高產(chǎn)生iPSCs的安全性,本研究采用多順反子質(zhì)粒載體在無飼養(yǎng)層細(xì)胞條件下重編程脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)獲得iPSCs,旨在為再生醫(yī)學(xué)的深入研究和應(yīng)用提供更安全便利的細(xì)胞源。 首先,構(gòu)建了兩種多順反子質(zhì)粒載體pIRES2-OSKM-EGFP和pIRES2-OS-EGFP。以分別實現(xiàn)四因子和兩因子多順反子質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染人ADSCs的目標(biāo)。先以重疊PCR方法將酶切位點(EcoR I、SaL l和BamH I)與具有自我剪切功能的2A元件(P2A、T2A和E2A)序列插入至Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列之間；再將各個基因片段連接(Oct4-P2A-Sox2-T2A-Klf4-E2A-c-Myc, OSKM)構(gòu)建成單個開放閱讀框(open reading frame, ORF);最后以雙酶切、連接的方式插入pIRES2-EGFP質(zhì)粒載體,構(gòu)建成攜帶四因子的多順反子質(zhì)粒載體pIRES2-OSKM-EGFP.隨后以Nhe I酶切pIRES2-OSKM-EGFP作為模板,利用PCR方法克隆Oct4-P2A-Sox2片段,再以重疊PCR方法在Oct4-P2A-Sox2序列兩端添加酶切位點Nhe I和Sac I,然后以雙酶切、連接的方式插入pIRES2-EGFP質(zhì)粒載體,構(gòu)建成攜帶Oct4和Sox2兩個基因的多順反子質(zhì)粒載體pIRES2-OS-EGFP。經(jīng)過設(shè)計特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)和測序鑒定,證實所構(gòu)建的兩種多順反子質(zhì)粒載體序列正確。因此,本實驗成功采用2A元件構(gòu)建了兩種質(zhì)粒載體pIRES2-OSKM-EGFP和pIRES2-OS-EGFP。 然后,先使用構(gòu)建的四因子多順反子質(zhì)粒pIRES2-OSKM-EGFP載體轉(zhuǎn)染人ADSCs,在無飼養(yǎng)層細(xì)胞條件下將其重編程為iPSCs。首先分離培養(yǎng)ADSCs,將傳代培養(yǎng)至第四代的ADSCs用pIRES2-OSKM-EGFP質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染一次,間隔4天后進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染。光學(xué)顯微鏡下觀察,在轉(zhuǎn)染后的3～4周,當(dāng)有明顯的細(xì)胞克隆出現(xiàn)時,將集落邊緣界限清晰的細(xì)胞克隆進(jìn)行挑取,并分離傳代培養(yǎng)與鑒定。對重編程細(xì)胞的相關(guān)檢測結(jié)果表明：細(xì)胞克隆的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)表現(xiàn)為陽性；定量RT-PCR檢測內(nèi)源性多潛能相關(guān)基因Oct4、Sox2、 Klf、 c-Myc和TERT的mRNA呈高水平表達(dá)；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)顯示其表達(dá)多能性標(biāo)志蛋白分子Oct4、 Nanog、TRA-1-60和SSEA4;細(xì)胞保持正常核型。更重要的是,Southern blot檢測結(jié)果表明,無質(zhì)粒載體序列插入／整合到iPSC基因組中。此外,體外分化實驗證實可形成擬胚體(embryonic bodys, EBs)并具有分化成三胚層細(xì)胞類型的能力；體內(nèi)分化實驗則表明,該細(xì)胞可形成畸胎瘤并具有分化形成三個胚層組織的能力。因此,本實驗成功使用多順反子質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染了ADSCs,并將其重編程為iPSCs;經(jīng)過細(xì)胞特異性標(biāo)記基因檢測和分化能力檢測,證實iPSCs具有類似胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)的形態(tài)與功能。 接著,使用僅攜帶兩個多能性因子Oct4和Sox2的多順反子質(zhì)粒pIRES2-OS-EGFP載體轉(zhuǎn)染ADSCs并將其重編程為具備多能性細(xì)胞特點與功能的iPSCs.先以pIRES2-OS-GFP質(zhì)粒載體第一次轉(zhuǎn)染ADSCs細(xì)胞,以轉(zhuǎn)染當(dāng)天計為向iPSCs誘導(dǎo)的第0天,在第7天后進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染。在含有4ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的干細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)傳代,21天后逐步分離出集落邊緣界限清晰的細(xì)胞克隆。高倍鏡下集落中的單個細(xì)胞核較大,核質(zhì)比例較高；細(xì)胞集落生長穩(wěn)定,核型正常；AP檢測其為陽性；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞表達(dá)Oct4、Nanog、 TRA-1-60和SSEA4; RT-PCR檢測其表達(dá)ESCs的標(biāo)志基因。經(jīng)體內(nèi)體外分化實驗,可分別檢測到形成三個胚層的EBs和畸胎瘤,并且無質(zhì)粒載體序列插入／整合至iPSCs基因組中。上述實驗結(jié)果顯示,只采用多順反子質(zhì)粒載體攜帶Oct4和Sox2兩個轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染ADSCs,仍然可以使其重編程為iPSCs。 最后,使用多順反子質(zhì)粒pIRES2-OSKM-EGFP載體重編程ADSCs獲得多能性后,又進(jìn)行了該細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究。先使用質(zhì)粒載體對傳代至第六代的ADSCs轉(zhuǎn)染操作,以轉(zhuǎn)染操作當(dāng)天計為第0天。為達(dá)到更高轉(zhuǎn)染效率,細(xì)胞培養(yǎng)4天后進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染。在第一次轉(zhuǎn)染后的第7天,將原來的ADSCs生長培養(yǎng)基更換為添加G418藥物的篩選培養(yǎng)基；一周后,更換為不含有G418藥物的培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選后繼續(xù)培養(yǎng)。相關(guān)結(jié)果表明：經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測,重編程細(xì)胞表達(dá)多能性蛋白標(biāo)記Oct4、 Nanog、TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA4; RT-PCR結(jié)果顯示,細(xì)胞不僅表達(dá)多能性相關(guān)基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc,還表達(dá)ESCs多能性特異基因REX1和TERT;細(xì)胞核型正常,無質(zhì)粒載體序列插入／整合到iPSCs基因組中。而且,將重編程的多能細(xì)胞培養(yǎng)在神經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中,并經(jīng)過3周的誘導(dǎo)培養(yǎng)后,細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)蛋白標(biāo)志分子Nestin、GFAP、TUJl、RIP和Nurrl。進(jìn)而通過免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),在培養(yǎng)板中隨機(jī)選取不同視野,計算了表達(dá)不同蛋白標(biāo)志分子陽性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)目比例,結(jié)果顯示：GFAP70.5±8.0%(n=258)、 TUJ182.7±7.3%(n=266)、RIP60.4±5.2%(n=212)和Nurr173.6±9.2%(n=244).因此,本試驗經(jīng)過細(xì)胞形態(tài)和標(biāo)志分子表達(dá)檢測,成功誘導(dǎo)了ADSCs來源的多能細(xì)胞,并使其向神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生了分化。 本研究分別構(gòu)建多順反子質(zhì)粒載體pIRES2-OSKM-EGFP和pIRES2-OS-EGFP,在無飼養(yǎng)層細(xì)胞條件下分別重編程ADSCs獲得iPSCs,提高了所產(chǎn)生的iPSCs的安全性。
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3416

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 丁道芳;王臻;徐浩;徐樂勤;梁倩倩;趙永見;施杞;王擁軍;;真核表達(dá)BMP4成熟肽及其對iPS細(xì)胞的分化抑制作用(英文)[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2012年10期

2 夏小雨;褚建新;陳學(xué)進(jìn);;分化細(xì)胞經(jīng)特定因子誘導(dǎo)重編程為多能干細(xì)胞[J];生物工程學(xué)報;2008年07期

3 顧文佳,龐希寧;誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化方法的研究與探討[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2004年02期

4 陳倩;史慶華;;iPS細(xì)胞的遺傳安全性[J];遺傳;2012年03期

，

本文編號：2695126