【摘要】：目的：骨缺損修復一直是醫(yī)學研究的重點之一。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)以其生物學特性吸引了諸多學者的目光。氧作為生命活動所必需的環(huán)境因素,對間充質(zhì)干細胞的增殖、分化具有重要的調(diào)節(jié)作用,同樣,氧的存在也是MSCs的存活、增殖和分化過程中不可缺少的條件之一。骨髓中的氧大約是1%-7%pO2,這比一般環(huán)境中的20%低很多。在病理條件下如骨缺損的修復過程中,MSCs需保持在更低的氧的環(huán)境中發(fā)揮它應有的作用。本實驗的目的是研究低氧對MSCs成骨分化的影響;在MSCs的成骨分化過程中低氧與Notch信號之間的關(guān)系以及低氧條件下Notch(?)言號對MSCs成骨分化影響的機制。 方法：在1%pO2(低氧)或21%pO2(正常氧)氧下培養(yǎng)MSCs,對目的細胞分別進行ALP活性分析,實時PCR指定基因表達分析, ARS著色礦化檢測；在MSCs分化過程中通過實時PCR在7天、14天、21天的時候檢鋇(?)Notch1的表達水平,通過免疫印跡檢鋇(?)Notch1的蛋白表達水平；Notch1專一性的慢性病毒調(diào)節(jié)shRNA注入MSCs以抑偉(?)Notch(?)言號活性；在成骨誘導條件下培養(yǎng)7天以后,觀測ALP活性、Runx2、OPN和OCN的mRNA表達水平及成骨礦化水平；在低氧和正常氧條件下測量Runx2在對照Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染MSCs中和Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染MSCs中蛋白表達水平；免疫沉淀實驗研究Notch1和Runx2的關(guān)系；使用骨鈣素和纖連蛋白啟動子熒光素酶實驗測Runx2的轉(zhuǎn)錄活性。 結(jié)果：體外培養(yǎng)后細胞的ALP活性在低氧條件下比正常氧條件下低很多(p0.01)；實驗組低氧組中三種基因的表達水平比正常氧條件下低很多(p0.01)；相應的,在形態(tài)學表現(xiàn)上,低氧條件下培養(yǎng)的MSCs分化的礦化水平相比正常氧條件下顯著降低(p0.01)。實時PCR在7天、14天、21天的時候檢測(?)Notch1的表達水平發(fā)現(xiàn)與正常氧相比,Notch1(?)勺表達在低氧條件下顯著升高。和(?)mRNA水平一致,Notch1在低氧條件下培養(yǎng)的MSCs7天、14天、21天各個時間點中的蛋白表達水平顯著增加。Notch1專一性的慢性病毒調(diào)節(jié)shRNA被注入MSCs來抑制Notch信號活性。Notch1的表達被shRNA明顯抑制。當Notch1shRNA和控制shRNA轉(zhuǎn)化的MSCs在成骨誘導條件下培養(yǎng)7天以后,在對照組細胞中,ALP活性在低氧條件下比在正常氧條件下低很多；在Notch1抑制的細胞中,ALP活性差異在兩種條件下不明顯。除此之外,Runx2, OPN和OCN的mRNA表達水平在控制(?)shRNA轉(zhuǎn)化組中低氧和正常氧下差別很大,但在Notch1shRNA轉(zhuǎn)化組中就不明顯。相同的,礦化水平差異在shRNA轉(zhuǎn)化細胞中不明顯,但是在對照組中就很明顯。我們進一步研究了低氧通過Notch信號抑制MSCs成骨分化的機制。基于Runx2對于成骨細胞分化是很關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,在低氧和正常氧條件下測量Runx2在對照Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染MSCs中和Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染MSCs中蛋白表達水平。不管是在低氧還是正常氧條件下,Notch1抑制都可導致Runx2的上調(diào)。另外,免疫沉淀實驗顯示Notch1可以綁定在Runx2上。為了進一步研究Notch1和Runx2之間綁定的功能性結(jié)果,在對照組和Notch1shRNA轉(zhuǎn)染組中Runx2的轉(zhuǎn)錄活性通過使用骨鈣素和纖連蛋白啟動子熒光素酶實驗測定。Runx2的轉(zhuǎn)錄活性在Notch1抑制后顯著提高。 結(jié)論：低氧抑制MSCs成骨分化；在MSCs的成骨分化過程中低氧可激活Notch信號；Notch信號對于MSCs成骨分化的低氧性損傷是必須的；Notch通過直接綁定在Runx2上抑制Runx2的轉(zhuǎn)錄活性。
【學位授予單位】：南開大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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