【摘要】：目的：間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植對(duì)缺血-再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)等造成的腎組織損傷具有保護(hù)和促修復(fù)作用,是一種有效的細(xì)胞替代療法,然而其確切的作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討MSCs對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用,以及巨噬細(xì)胞在MSCs發(fā)揮腎保護(hù)性作用機(jī)制中的影響,從而揭示一種新的間質(zhì)干細(xì)胞移植治療腎損傷的機(jī)制,為MSCs的臨床應(yīng)用提供必要的理論基礎(chǔ)與依據(jù)。 方法：采用人臍帶來源的間質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSCs),經(jīng)尾靜脈移植治療C57BL/6小鼠腎缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)模型,并分別于術(shù)前、再灌注后1～10天內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)收集小鼠血液、組織標(biāo)本,觀察hucMSCs的腎保護(hù)作用并探討機(jī)制。采用紅色熒光染料CM-Dil標(biāo)記技術(shù),對(duì)hucMSCs進(jìn)行體內(nèi)示蹤定位。檢測(cè)小鼠血清中肌酐(creatinine, Cr)與尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)水平,評(píng)價(jià)hucMSCs治療前后I/R損傷小鼠的腎功能改善情況。腎組織切片H＆E染色及小管損傷評(píng)分揭示hucMSCs對(duì)腎組織結(jié)構(gòu)完整性的保護(hù)作用。通過PCNA免疫染色以及TUNEL分析hucMSCs移植對(duì)腎組織細(xì)胞增殖、凋亡的影響。免疫組織化學(xué)法對(duì)各組動(dòng)物腎臟中F4/80+巨噬細(xì)胞進(jìn)行染色,評(píng)價(jià)hucMSCs處理前后I/R損傷腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量的改變。同時(shí),經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎臟中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protine-1, MCP-1)的表達(dá),從損傷微環(huán)境中趨化因子的角度初步探討hucMSCs影響巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的可能機(jī)制。流式分析腎組織中CD206+細(xì)胞占CDllb+巨噬細(xì)胞的百分比,評(píng)價(jià)hucMSCs對(duì)體內(nèi)巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)換的作用。通過尾靜脈注射脂質(zhì)體包裹的氯膦酸鹽(liposome-dichloromethylene bisphosphonate, lipo-Cl2MBP)清除動(dòng)物模型內(nèi)的單核-巨噬細(xì)胞,再經(jīng)腎組織病理切片觀察其對(duì)hcMSCs發(fā)揮損傷修復(fù)作用的影響。采用定量RT-PCR分析hucMSCs治療前后以及巨噬細(xì)胞清除后小鼠腎組織中炎癥因子IL-1p、IL-6和IL-10的mRNA水平,研究損傷局部炎癥狀態(tài)的改變。在體外,將RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞株與hucMSCs共培養(yǎng),分別檢測(cè)了巨噬細(xì)胞的免疫表型及炎癥因子的表達(dá)。流式細(xì)胞儀分析共培養(yǎng)后RAW264.7細(xì)胞表面M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD206的表達(dá)情況；RT-PCR及ELISA分析RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、IL-6、arginase-1和IL-10的mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：hucMSCs經(jīng)尾靜脈注射后,可遷移、定位至小鼠肺臟與損傷腎臟的局部。hucMSCs治療組小鼠各時(shí)間點(diǎn)血清Cr、BUN水平明顯下降,腎組織損傷程度減輕,且腎小管細(xì)胞的增殖加速、凋亡減少。hucMSCs治療組小鼠與PBS對(duì)照組相比,其腎組織中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少,以再灌注后5天改變最為顯著。同時(shí),免疫組織化學(xué)分析表明I/R損傷的腎小管上皮細(xì)胞高表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞有趨化作用的因子MCP-1,而hucMSCs處理可降低該因子在腎組織中的表達(dá)。對(duì)IRI晚期(再灌注后5天)腎組織中巨噬細(xì)胞的免疫學(xué)分型進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),hucMSCs治療組與PBS對(duì)照組相比,其腎組織中具有促修復(fù)作用的M2型巨噬細(xì)胞比例明顯增加。清除I/R損傷早期小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞,對(duì)hucMSCs的組織修復(fù)具有明顯的促進(jìn)作用；相反,對(duì)IRI晚期體內(nèi)巨噬細(xì)胞的清除則可抑制hucMSCs的腎保護(hù)性作用。定量RT-PCR結(jié)果顯示,hucMSCs治療組的促炎因子合成減少而抑炎因子表達(dá)增高,具有緩解損傷局部炎癥的作用。體外與hucMSCs非接觸共培養(yǎng)(Transwell)或直接接觸培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞株RAW264.7,其CD206表達(dá)水平明顯高于RAW264.7細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組,且炎癥因子IL-1p、IL-6表達(dá)降低,arginase-1與IL-10表達(dá)升高。 結(jié)論：hucMSCs移植對(duì)C57BL/6小鼠的腎缺血-再灌注損傷具有保護(hù)及促修復(fù)作用。該治療作用的發(fā)揮與其減少腎組織內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),加速損傷局部炎癥消退以及促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換有關(guān)。hucMSCs通過對(duì)損傷局部以及體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中巨噬細(xì)胞免疫表型以及炎癥因子表達(dá)譜的調(diào)節(jié),促進(jìn)其向具有修復(fù)功能的M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變,從而發(fā)揮修復(fù)腎組織損傷的作用。與干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和旁分泌治療機(jī)制相比,本研究提出干細(xì)胞修復(fù)急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)的過程中有不同亞型巨噬細(xì)胞的參與,這為MSCs體內(nèi)發(fā)揮促損傷修復(fù)作用提供了一種新的機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 項(xiàng)帥;陳孝平;張偉;梁慧芳;張斌豪;劉旭;;脂質(zhì)體包裹氯膦酸二鈉剔除大鼠肝臟枯否細(xì)胞作用的研究[J];腹部外科;2010年02期

2 李康;郭強(qiáng);王翠妮;陳敏;徐薇;熊思東;;M1和M2型巨噬細(xì)胞表型的比較分析[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2008年03期

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本文編號(hào)：2694437